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La paroi cellulaire mycobactérienne contient différentes variantes d’acides mycoliques - des acides gras à longue chaîne avec des chaînes alpha conservées. Des différences structurelles existent dans leurs chaînes bêta, ce qui entraîne des variations de polarité des différents acides mycoliques.
Pour séparer les variants à l’aide de la chromatographie sur couche mince, ou TLC - une technique de chromatographie liquide - prenez les lipides de la paroi cellulaire mycobactérienne dans le solvant organique souhaité. Repérez les lipides près de la base d’une plaque CCM pré-enduite d’une fine couche de matériau adsorbant, qui fonctionne comme la phase stationnaire.
Placez la plaque à l’intérieur d’un bocal contenant un solvant organique - la phase mobile - en veillant à ce que le niveau de liquide soit inférieur aux points d’échantillonnage pour éviter la diffusion prématurée des acides mycoliques.
Pendant le fonctionnement, la phase mobile monte à travers les minuscules pores de la couche adsorbante sur la plaque par capillarité. Finalement, les acides mycoliques se dissolvent dans le solvant et se déplacent vers le haut.
Des variantes plus polaires de l’acide mycolique sont adsorbées transitoirement par la phase stationnaire polaire via des forces intermoléculaires, entravant leur mouvement ascendant. Les acides mycoliques moins polaires restent dans la phase mobile non polaire et migrent plus loin.
Les différences de migration font que les variantes de l’acide mycolique se séparent en bandes discrètes.
Une fois terminé, vaporisez la plaque séchée avec une coloration à l’acide phosphomolybdique. Chauffez la plaque pour réduire la tache en présence des lipides, conférant une couleur vert foncé aux bandes.
Pour analyser les échantillons par CCM, couvrez une paroi de la chambre CCM avec un morceau de papier filtre. Ajoutez de la vaseline sur les coins de la chambre pour sceller la chambre. Transvasez le mélange de solvant sur le papier filtre et ajoutez le volume restant du solvant au fond de la chambre TLC. Fermez la chambre TLC pendant au moins 20 minutes pour la saturer
Pendant ce temps, dissolvez les lipides dans le tube de verre dans 200 à 1 000 microlitres de chloroforme, et utilisez un tube de verre capillaire pour appliquer 10 microlitres de suspension lipide-chloroforme directement sur la plaque TLC. Après avoir laissé sécher l’échantillon pendant cinq minutes, insérez la plaque dans la chambre CCM saturée et laissez la phase mobile traverser la CCM.
Lorsque le solvant atteint 1 centimètre de l’extrémité supérieure de la plaque, placez la plaque sous flux laminaire jusqu’à ce que la silice soit complètement sèche. Ensuite, vaporisez la plaque séchée avec 15 à 20 millilitres d’hydrate d’acide molybdatophosphorique à 10 % dans de l’éthanol, jusqu’à ce que la plaque soit jaune vif, et chauffez la plaque pendant deux à cinq minutes à 120 degrés Celsius.