Purification de baculovirus basée sur la chromatographie d’affinité d’héparine : une technique pour isoler le baculovirus du surnageant de cellules d’insectes

Les baculovirus - des virus à ADN double brin - sont entourés d’une enveloppe contenant les principales glycoprotéines virales, comme la GP64.

Pour isoler les baculovirus d’un surnageant de culture cellulaire contenant des débris cellulaires et des protéines contaminantes, assemblez une colonne de chromatographie d’affinité à l’héparine contenant une matrice de billes d’agarose réticulées. Ces billes sont couplées à l’héparine, un polysaccharide linéaire avec des groupes sulfates, qui confèrent une charge négative à la chaîne d’héparine.

Équilibrez la colonne avec un tampon de lavage ayant un pH neutre et une force ionique optimale pour fournir des conditions favorables à des interactions maximales entre le baculovirus et l’héparine pendant le chargement du surnageant. Chargez le surnageant contenant le baculovirus sur la colonne.

Les acides aminés basiques du baculovirus GP64 facilitent les interactions électrostatiques non spécifiques avec l’héparine chargée négativement et se lient étroitement à la colonne, contrairement aux contaminants qui se lient lâchement. Rincez la colonne avec un tampon de lavage, en éliminant les protéines et les débris contaminants non liés et faiblement liés.

Faites passer un tampon d’élution avec une force ionique plus élevée que le tampon de lavage à travers la colonne. La force ionique plus élevée perturbe les interactions électrostatiques entre le baculovirus et l’héparine, dissociant et éluant les baculovirus de la colonne.

Prélever l’éluat contenant le baculovirus dans le circuit écoulement. Diluez immédiatement la suspension de baculovirus avec un tampon contenant des concentrations physiologiques en sel, empêchant ainsi l’inactivation du virus. Les baculovirus isolés peuvent être utilisés pour une analyse plus approfondie.

Installez le système de chromatographie en plaçant la ligne de tampon de lavage de l’orifice d’entrée A1 dans une bouteille contenant au moins 500 millilitres de tampon de lavage. Utilisez l’orifice d’entrée du tampon A2 pour charger le tampon d’élution.

Insérez plusieurs tubes coniques de 50 millilitres dans le collecteur de fractions pour recueillir le surnageant du baculovirus de passage en colonne, le tampon de lavage et le baculovirus élué. Équilibrez la colonne d’héparine avec cinq volumes de colonne de 7,9 millilitres de tampon de lavage, à un débit linéaire de 7 millilitres par minute.

Chargez 250 millilitres de surnageant de baculovirus sur la colonne d’héparine, à l’aide de la pompe d’échantillonnage de l’orifice d’entrée de l’échantillon à un débit linéaire de 2 millilitres par minute. Ensuite, faites passer 10 volumes de colonne de tampon de lavage à travers la colonne d’héparine à un débit linéaire de 2 millilitres par minute, jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette soit revenue à la ligne de base et devienne stable.

Diluez les particules de baculovirus de la colonne d’héparine avec cinq volumes de colonne de tampon d’élution à un débit linéaire de 4 millilitres par minute. Surveillez l’apparition d’un pic d’élution brutale de la protéine sur le chromatogramme lorsque les particules du baculovirus se dissocient de la colonne d’héparine.

Après l’élution, diluer immédiatement le surnageant du baculovirus élué 10 fois à l’aide d’un tampon de phosphate de sodium de 20 millimolaires pour empêcher l’inactivation des particules de baculovirus par choc osmotique lors de la centrifugation ultérieure.