Chromatographie échangeuse de cations : technique d’isolement d’une protéine recombinante cible à partir d’un lysat de cellule d’insecte sur la base de la charge de surface nette

La chromatographie échangeuse de cations facilite la séparation des protéines des mélanges en fonction de leur charge de surface nette.

Pour isoler la protéine du transducteur de signal cible à partir du lysat de protéines de cellules d’insectes, obtenir un lysat de protéines cibles dialysé contenant d’autres protéines contaminantes. Ajoutez un tampon contenant du chlorure de sodium pour réduire la viscosité du lysat et améliorer la solubilité des protéines, ce qui aide à prévenir l’obstruction de la colonne chromatographique pendant le fonctionnement.

De plus, le pH tampon en dessous du point isoélectrique de la protéine cible, pI, auquel la protéine a une charge nette nulle, facilite la liaison des ions hydrogène en excès aux groupes carboxylates négatifs, ce qui rend la protéine cible chargée positivement.

Assembler la colonne chromatographique contenant des billes d’agarose réticulées couplées à des groupes chargés négativement. Ajoutez un tampon de liaison pour équilibrer la colonne et maximiser les interactions colonne-protéine. Chargez le lysat dilué sur la colonne équilibrée.

Les protéines cibles chargées positivement interagissent et se lient étroitement aux groupes chargés négativement de la colonne que les protéines contaminantes moins chargées positivement.

Lavez la colonne avec un tampon pour éliminer les protéines contaminantes chargées négativement non liées. Par la suite, passez le tampon d’élution, tout en augmentant progressivement sa force ionique.

À faible force ionique, il y a une compétition minimale entre les ions positifs et les protéines pour les groupes négatifs de la colonne, éluant des protéines contaminantes faiblement liées et moins chargées positivement. Cependant, à mesure que la force ionique augmente, les ions sel entrent en compétition avec les protéines transductrices de signal cible étroitement liées et réduisent les interactions entre les protéines et la colonne, les éluant sous forme de fraction purifiée.

Préparez une colonne d’échange cationique de 20 millilitres en la lavant avec trois volumes de colonne de tampon G, puis avec trois volumes de colonne de tampon F. Ensuite, diluez 20 millilitres de l’échantillon dialysé jusqu’à une concentration finale de chlorure de sodium de 100 millimolaires, en ajoutant 20 millilitres de tampon E, et appliquez l’échantillon dans la colonne d’échange.

Il est essentiel de diluer la petite quantité de l’échantillon plutôt que de tout d’un coup, et les échantillons dilués doivent être appliqués sur la colonne immédiatement après la dilution pour limiter la précipitation de la protéine.

Continuez à charger la colonne avec l’échantillon fraîchement dilué à mesure que la dilution précédente approche de la fin de la charge. Ensuite, lavez la colonne à l’absorbance de base de 280 avec le tampon F, ce qui nécessitait généralement trois volumes de colonne.

Éluer la protéine de la colonne avec un gradient de 400 millilitres du tampon F à 65 % du tampon G, en recueillant l’éluat en fractions de 6 millilitres. Une fois le dégradé terminé, continuez à laver la colonne pour obtenir 1,5 volume de colonne supplémentaire de 65 % de tampon G.