Séparation basée sur la chromatographie d’exclusion stérique des vésicules extracellulaires bactériennes : une technique pour séparer une population hétérogène de vésicules de membrane externe bactérienne à Gram négatif en fonction de leur taille

Dans des conditions de culture appropriées, les bactéries à Gram négatif libèrent des vésicules de membrane externe transportant des marchandises, ou OMV, dans le surnageant. Ces vésicules sont de petites structures sphériques de taille hétérogène, qui interviennent dans la communication cellulaire.

Pour fractionner des sous-populations d’OMV de différentes tailles, prenez une colonne de chromatographie d’exclusion stérique vide avec un filtre approprié à sa base pour soutenir la matrice.

Emballez la colonne avec une matrice de filtration de gel composée de billes sphériques chimiquement inertes de taille de pores définie, en veillant à ce que la taille soit optimale pour empêcher les OMV de grande taille d’entrer. Equilibrez la colonne avec un tampon approprié pour éviter que les billes ne sèchent pour une purification optimale.

Chargez le surnageant de culture bactérienne contenant des sous-populations de différentes tailles d’OMV, d’agrégats de protéines et d’acides nucléiques sur le dessus de la colonne. Laissez les échantillons s’écouler sous l’effet de la force de gravité.

Au fur et à mesure que les échantillons traversent la colonne, les OMV plus grands, qui ne peuvent pas pénétrer dans les pores, se déplacent à travers les espaces interparticulaires entre les billes de gel pour être élués en premier. Pendant ce temps, les plus petits OMV pénètrent dans les pores de la matrice, empruntent un chemin plus long et éluent plus tard.

En raison de leur taille plus petite, les agrégats de protéines et les acides nucléiques pénètrent dans divers pores de la matrice, ce qui leur permet d’avoir le plus long temps de rétention dans la colonne et d’éluer comme les dernières fractions. Collectez des éluats OMV séparés et stockez-les pour une analyse plus approfondie.

Pour commencer, utilisez une tige de verre pour mélanger une bouteille de stock de média de filtration en gel et versez le volume nécessaire pour remplir la colonne plus environ 50 % de l’excédent dans une bouteille en verre. Laissez les billes se déposer et décantez l’excès de liquide. Remettre les billes en suspension dans le tampon d’élution jusqu’à une solution finale d’environ 70 % de gel et 30 % de tampon, et dégazer la solution sous vide.

Montez la colonne sur un support annulaire en position verticale et remplissez la colonne avec un tampon d’élution pour mouiller les parois, avant de vider le tampon jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’environ 1 centimètre. Ensuite, pipetez soigneusement les billes de gel dans la colonne, tout en vidant simultanément l’excès de tampon pour éviter que les billes ne se déposent, jusqu’à ce que la colonne soit remplie à une hauteur d’environ 2 centimètres sous le fond du réservoir de la colonne.

Avant de charger l’échantillon, dégazez le tampon d’élution sous vide. Lavez la colonne avec environ deux fois le volume de la colonne de tampon d’élution. Une fois que le tampon atteint le sommet de la couche de gel, ajoutez soigneusement 2 millilitres d’un échantillon de vésicule de membrane externe de 100 à 200 nanomoles par litre sur la couche de gel sans perturber la surface, et laissez l’échantillon pénétrer dans le gel.

Lentement, ajoutez le tampon d’élution à la colonne sans perturber la couche de gel et placez un tube de 50 millilitres sous la colonne. Pour éviter que la colonne ne sèche, ajoutez simultanément un tampon d’élution au sommet de la colonne.

Après avoir recueilli 20 millilitres d’éluat, placez un rack de tubes de 1,5 millilitre sous la colonne. Recueillir un total de 96 fractions de 1 millilitre dans chaque tube. Lors de la collecte des échantillons, ajoutez continuellement un tampon d’élution à la colonne. Pour nettoyer la colonne, faites passer 1 volume de colonne d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire à travers la colonne, suivi de 2 volumes de colonne de tampon d’élution.