Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse : une méthode robuste pour la quantification d’acides sialiques marqués par fluorescence et dérivés isolés du foie de souris

Les acides sialiques, tels que l’acide N-acétylneuraminique et l’acide N-glycolylneuraminique, sont des fractions glucidiques chargées négativement que l’on trouve aux extrémités distales des chaînes d’oligosaccharides à la surface des cellules de mammifères.

Pour quantifier les quantités relatives de ces acides sialiques dans le tissu hépatique de souris à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse ou RP-HPLC, traitez d’abord le mélange isolé d’acide sialique avec un agent de dérivatisation. L’agent de dérivatisation interagit avec les groupes fonctionnels des acides sialiques, générant des dérivés stables et fluorescents de l’acide sialique.

Assemblez une colonne RP-HPLC, connectée à un détecteur de fluorescence. La colonne comprend une phase stationnaire poreuse à base de silice liée à des ligands de chaînes alkyles non polaires et hydrophobes pour faciliter les interactions sélectives avec les dérivés de l’acide sialique pendant l’exécution chromatographique.

Équilibrer la colonne à l’aide d’une phase mobile polaire aqueuse contenant de faibles concentrations d’acétonitrile, un solvant organique moins polaire, pour un conditionnement optimal de la colonne.

Chargez le mélange d’acide sialique dérivé dans la colonne.

L’acide N-acétylneuraminique, contenant un groupe N-acétyle hydrophobe, s’adsorbe plus fortement sur les ligands hydrophobes de la phase stationnaire que l’acide N-glycolylneuraminique avec un groupe N-glycolyle hydrophile.

Analysez les échantillons à l’aide d’un système HPLC standard connecté à un détecteur de fluorescence en ligne. Utilisez une colonne C-18 en phase inverse d’une longueur de 250 millimètres et d’un diamètre de 4,6 millimètres pour l’analyse.

Après avoir préparé le solvant A et le solvant B, et configuré le cycle HPLC comme détaillé dans le protocole textuel, injectez 50 microlitres de l’échantillon dans le système HPLC.

Surveillez les éluants, en utilisant la longueur d’onde d’excitation du détecteur de fluorescence de 373 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 448 nanomètres.

Enfin, calculez la quantité relative de Neu5Gc comme décrit dans le protocole texte.