Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:05 min • July 8th, 2025
Les protéines membranaires intégrales bactériennes, ancrées aux membranes bicouches lipidiques, facilitent le transport des molécules à travers les membranes et la transduction des signaux. Pour les études structurales, des protéines recombinantes membranaires intégrales spécifiques sont surexprimées avec la protéine fluorescente verte fusionnée, GFP.
Pour évaluer la stabilité des protéines membranaires recombinantes après solubilisation au détergent, obtenir une fraction membranaire bactérienne contenant des protéines membranaires intégrales marquées à la GFP. Ajoutez un détergent non ionique. Au-delà de la concentration critique, le détergent forme des micelles.
Les micelles interagissent avec les membranes lipidiques et les protéines membranaires, solubilisant les membranes et formant des complexes protéine-détergent. De plus, les régions transmembranaires hydrophobes des protéines membranaires peuvent rester non masquées, provoquant l’agrégation des protéines. De plus, des GFP libres peuvent résulter de la dégradation des protéines membranaires.
Centrifugez le mélange. Recueillir le surnageant contenant une fraction solubilisée dans un détergent.
Assemblez une colonne de chromatographie d’exclusion stérique reliée à un détecteur de fluorescence. La matrice de colonne comprend des billes d’agarose avec des tailles de pores définissant une large plage de fractionnement.
Équilibrez la colonne avec un tampon contenant un détergent pour minimiser les interactions non spécifiques et maintenir la solubilisation des protéines.
Chargez la fraction membranaire solubilisée dans la colonne. Les agrégats de protéines échappent aux pores les plus grands et se déplacent à travers les espaces interparticulaires entre les billes, en éluant les premiers. Des complexes protéine-détergent plus petits pénètrent dans quelques pores des billes, parcourant un chemin plus long, et éluent plus tard. Les GFP libres pénètrent dans tous les pores des billes et éluent en dernier. Le détecteur de fluorescence analyse les fractions éluées, détectant la fluorescence émise par la GFP.
Des pics de fluorescence symétriques de complexes protéine-détergent avec des agrégats minimaux et une GFP libre indiquent l’aptitude du détergent à la solubilisation des protéines membranaires.
Pour la chromatographie d’exclusion stérique détectée par fluorescence ou l’analyse FSEC, ensuite, équilibrez une colonne d’exclusion stérique avec une large plage de fractionnement avec un tampon de débit continu à une vitesse de 0,3 millilitre par minute. Ensuite, injectez 100 microlitres d’un échantillon de membrane solubilisé dans la colonne au même débit, et surveillez le profil d’illusion à l’aide d’optiques de fluorescence.