Dosage de l’activité enzymatique basé sur la chromatographie sur couche mince : une technique pour déterminer l’activité de la pyrophosphokinase in vitro à l’aide de la chromatographie sur couche mince

La pyrophosphokinase catalyse le transfert de diphosphate ou de pyrophosphate du précurseur nucléotidique, comme l’adénosine triphosphate, ATP, vers un substrat comme la guanosine diphosphate, GDP. Cela forme du tétraphosphate de guanosine - une molécule de signalisation importante.

Pour déterminer l’activité de la pyrophosphokinase, préparer un mélange réactionnel comprenant des GDPs et des ATP radiomarqués dans un tampon approprié complété par du chlorure de magnésium. Ajouter la quantité désirée de pyrophosphokinase au mélange réactionnel et incuber.

Au fil du temps, en présence d’ions magnésium, la pyrophosphokinase commence à transférer la fraction pyrophosphate radiomarquée de l’ATP au GDP, produisant ainsi du tétraphosphate de guanosine radioactif.

Maintenant, prenez une chromatographie sur couche mince ou TLC, plaque prérecouverte de polyéthylénimine-cellulose - une phase stationnaire à base de polymère cationique. Repérez les aliquotes des analytes du mélange réactionnel près de la base de la plaque CCM à différents moments pour arrêter la réaction et évaluer la progression.

Plongez la plaque dans une chambre en verre contenant du phosphate de potassium monobasique - un solvant en phase mobile. Au fur et à mesure que le front du solvant se déplace vers le haut, les analytes chargés négativement commencent à migrer en fonction de leurs affinités avec la phase stationnaire chargée positivement.

Les différences de charges négatives et de poids des analytes phosphorylés différemment déterminent leur migration relative sur la plaque CCM, ce qui leur permet de s’immobiliser en bandes distinctes.

Lorsque le front du solvant atteint la distance souhaitée, retirez la plaque et séchez-la à l’air. Mesurer l’intensité du signal radioactif, correspondant à la déplétion en ATP marquée radioactivement et à l’accumulation de guanosine tétraphosphate pour analyser l’activité de la pyrophosphokinase.

Avant d’effectuer la réaction, préparez des plaques de chromatographie sur couche mince de cellulose-PEI en les lavant dans de l’eau désionisée. Placez les plaques dans une chambre en verre avec de l’eau distillée doublement, à une profondeur d’environ 0,5 centimètre. Après avoir laissé l’eau migrer vers le haut de l’assiette, sortez les assiettes de la chambre en verre et laissez-les sécher sur une grille de paillasse pendant la nuit.

Marquez les plaques sèches à 2 centimètres d’un bord avec un crayon doux, pour indiquer où les échantillons seront appliqués pour la CCM. Pour des échantillons de 2 microlitres, appliquez des échantillons à au moins 1 centimètre d’intervalle. Lors de la planification des expériences, laissez toujours un endroit inutilisé sur chaque plaque, pour servir de voie vide pour la quantification de l’échantillon.

Pour effectuer le dosage de l’activité enzymatique, préparez des réactions individuelles à l’aide du P-ATP ^γ-32, comme décrit dans le protocole textuel. Ajouter le RSH après que les autres composants ont été mélangés, car l’ajout de RSH au mélange contenant des nucléotides déclenche le dosage de l’activité enzymatique.

Pour contrôler l’hydrolyse de l’ATP due à la contamination de l’activité des nucléases, assemblez une réaction de 10 microlitres ne contenant aucune protéine et incubez-la en parallèle. Repérez 2 échantillons de microlitres à t = 0, et à la fin de l’expérience pour s’assurer que l’ATP n’a pas été hydrolysé en l’absence de protéine.

Immédiatement après l’ajout de RSH, prélever 2 microlitres et le repérer sur la plaque de cellulose PEI étiquetée comme t = échantillon de 0 minute.

Incuber la réaction à 37 degrés Celsius, en prélevant 2 aliquotes de microlitres aux points de temps souhaités. Une fois que toutes les aliquotes ont été recueillies, effectuez une chromatographie sur couche mince en remplissant la chambre de chromatographie avec 1,5 molaire de phosphate de potassium monobasique à une profondeur de 0,5 centimètre. Immergez le bord inférieur de la plaque dans le solvant et laissez le solvant migrer vers le haut de la plaque pendant environ 90 minutes.

Retirez la plaque de la cuve de chromatographie et placez-la sur une grille de séchage pour la faire sécher à l’air libre pendant la nuit. Une fois la plaque sèche, enveloppez-la dans un film plastique pour éviter le transfert de matière radioactive sur la cassette d’imagerie, et analysez-la par autoradiographie.

Exposer la plaque PEI-cellulose contenant les réactions séparées à une cassette de phosphorimageur pendant quatre heures à température ambiante. Après l’exposition, imagez la cassette sur un imageur phosphorescent.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie doté d’une interface utilisateur graphique, dessinez les régions d’intérêt, ou ROI, en sélectionnant d’abord « Dessiner un rectangle ». Ensuite, utilisez la souris pour dessiner des zones d’intérêt rectangulaires autour d’une voie entière, ainsi que les taches d’ATP et de tétraphosphate de guanosine contenues dans cette voie.

Utilisez les commandes « Sélectionner, Copier et Coller » pour dessiner des zones d’intérêt identiques dans les autres voies, afin de vous assurer que les zones d’intérêt mesurent des signaux dans des zones identiques dans chaque voie. Incluez les retours sur investissement d’une voie inutilisée à utiliser comme blancs.

À l’aide de l’option « Analyser | Outils | Responsable ROI | Ajouter" du logiciel d’imagerie, sélectionnez tous les ROI dessinés sur la plaque PEI-cellulose. Maintenant, utilisez l’option "Analyser | Définir les mesures | Measure" pour quantifier l’intensité du signal dans chaque retour sur investissement et exporter les mesures sous forme de tableur. Dans la feuille de calcul, soustrayez les valeurs de retour sur investissement vides des signaux expérimentaux.