Chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête : une technique pour évaluer la concentration d’éthanol dans les embryons de poisson-zèbre

Pour analyser la concentration d’éthanol - un composé organique volatil, commencez par prendre le surnageant de culture d’embryons de poisson-zèbre homogénéisé traité à l’éthanol dans un flacon de chromatographie. Le surnageant contient d’autres composés organiques non volatils en plus de l’éthanol. Placez le flacon scellé dans une unité d’échantillonnage de l’ensemble de chromatographie et chauffez-le à une température appropriée.

Pendant le chauffage, l’éthanol se vaporise et migre dans la phase gazeuse ou l’espace de tête, laissant derrière lui les résidus non volatils. Cela permet à l’échantillonneur d’introduire de l’éthanol gazeux dans un flux continu de gaz vecteur. Il s’agit d’une phase mobile.

L’éthanol passe à travers la colonne de chromatographie enroulée préchauffée, qui contient un lit garni de phase stationnaire liquide. En raison de leur volatilité et de leur polarité, les molécules d’éthanol en mouvement commencent à s’adsorber sur les particules de phase stationnaire, se répartissant en phase stationnaire.

En raison de la température élevée de la colonne, l’adsorption des molécules d’éthanol est instable et temporaire, ce qui permet à ces molécules de se désorber progressivement et de migrer le long du flux de gaz vecteur. Ces molécules d’éthanol subissent une série d’événements d’adsorption-désorption sur toute la longueur de la colonne.

Par la suite, l’éthanol entre dans une chambre de détection qui permet de déterminer sa concentration dans l’échantillon correspondant à l’aire sous la courbe dans le chromatogramme résultant.

Utilisez deux micropipettes p200 réglées à 50 microlitres et aspirez la solution cocktail de protéase dans l’une et l’eau dans la seconde. Ensuite, placez rapidement 10 embryons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en verre et fermez le bouchon. Répétez ce processus pour tous les échantillons à analyser, les témoins et les embryons traités à l’éthanol.

En travaillant avec un échantillon à la fois, ouvrez rapidement le capuchon et aspirez tous les milieux embryonnaires résiduels avec une micropipette p200 réglée à 200 microlitres. Rapidement, mais doucement, ajoutez et retirez les 50 microlitres d’eau, puis ajoutez les 50 microlitres de cocktail de protéase et fermez le capuchon du tube.

Laissez reposer l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante, puis ajoutez rapidement 450 microlitres de chlorure de sodium 5 molaires et fermez le capuchon du tube. Homogénéiser l’échantillon par vortex pendant 10 minutes et transférer 2 microlitres de surnageant dans un flacon de chromatographie en phase gazeuse. Fermez le flacon avec un bouchon en polytétrafluoroéthylène.

Après avoir terminé la méthode de démarrage, chargez 436 Current spme ethanol 2013 3-minute absorber 2_5min rg run. METH à partir du menu Méthodes du logiciel d’analyse pour chaque échantillon de la liste d’échantillons. Remplissez la liste d’échantillons, en commençant par l’air, l’eau et les blancs de cocktail de protéase de chlorure de sodium 5 molaires. Ensuite, entrez les normes d’éthanol dans l’ordre de 0,3125 à 40 millimolaires.

Suivez les normes avec la deuxième série de blancs. Entrez tous les échantillons de surnageant d’embryons homogénéisés à analyser, de la concentration d’éthanol prévue la plus faible à la plus élevée, et terminez en inscrivant une troisième série de blancs.

Ajouter les flacons de chromatographie en phase gazeuse dans l’échantillonneur automatique dans l’ordre dans lequel les échantillons ont été saisis et les laisser chauffer pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, démarrez les exécutions d’échantillons à l’aide du logiciel. Une fois toutes les exécutions terminées, activez la méthode d’arrêt en ajoutant un dernier échantillon dans la liste d’échantillons et en exécutant la veille. MÉTHAMPHÉTAMINE. Sauvegardez toutes les données acquises pendant l’exécution de l’échantillon.

Une fois la méthode d’arrêt terminée, cliquez sur Ouvrir le chromatogramme et ouvrez le dossier avec les résultats. Les échantillons sont automatiquement intégrés dans ce programme. Dans les résultats, assurez-vous que les bons pics ont été intégrés. Une fois que tous les échantillons ont été confirmés, imprimez ou exportez les résultats.

Tracez la hauteur maximale des étalons d’éthanol sur un graphique. Ensuite, calculez les valeurs de la pente, de l’ordonnée à l’origine et de l’ordonnée à l’origine et du R au carré. Obtenez la valeur d’éthanol pour chaque échantillon en soustrayant la hauteur du pic de l’échantillon de l’ordonnée à l’origine des étalons et en divisant cette valeur par la pente des étalons.

Pour calculer la concentration d’éthanol dans les embryons, calculez le facteur de dilution pour chaque échantillon et multipliez la valeur d’éthanol de l’échantillon par ce facteur de dilution. Enfin, calculez les échantillons de référence du milieu en multipliant la valeur de l’éthanol dans le milieu par un facteur de dilution de 10.