JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:15 min • July 8th, 2025
Les glycosaminoglycanes sulfatés comme les sulfates d’héparane, HS, sont des polysaccharides sulfatés, linéaires et chargés négativement, de longueurs de chaîne variables, attachés aux protéines de surface cellulaire.
Pour estimer les HS de différentes longueurs isolés dans le tissu pulmonaire de souris, commencez par l’assemblage de la cassette de gel. Remplissez-le partiellement d’une solution hautement concentrée d’acrylamide-bisacrylamide, y compris des agents catalyseurs - persulfate d’ammonium et tétra-méthyl-éthylène-diamine. Recouvrir d’eau pour éviter le contact avec l’air, ce qui peut inhiber la polymérisation. Couver.
Les agents catalyseurs induisent la polymérisation de l’acrylamide-bisacrylamide, formant un gel de résolution des petits pores. Jeter l’eau. Ajouter une solution à faible concentration d’acrylamide-bisacrylamide avec des agents catalyseurs. Insérez un peigne à gel pour créer des puits. La solution polymérise, formant un gel d’empilement à gros pores.
Chargez les chambres du réservoir d’électrophorèse avec un tampon de fonctionnement pour une conductivité électrique optimale pendant l’électrophorèse.
Dissoudre le mélange HS dans un tampon de chargement contenant du colorant de suivi et du saccharose. Ensuite, transférez ce mélange et les échelles HS standard dans des puits à cassette. Le saccharose confine le mélange dans les puits. Le colorant aide à surveiller la progression de l’électrophorèse.
Initier l’électrophorèse à basse tension. Les HS chargés négativement traversent le gel d’empilement, se déplaçant vers l’anode chargée positivement, et se concentrent à l’interface entre l’empilement et la résolution du gel en raison de la différence de taille des pores.
Augmentez la tension. Les HS à petite chaîne migrent rapidement à travers le gel de résolution, traversant plus loin, tandis que les HS à longue chaîne sont piégés dans la matrice de gel et se déplacent lentement.
Après l’électrophorèse, colorez le gel. Les SH apparaissent comme des bandes distinctes, les SH à petite chaîne se situant plus bas que les SH à longue chaîne. La longueur de chaque SH peut être déterminée en comparant avec les normes du SH.
Commencez par placer une cassette vide dans le réservoir PAGE. Coulez le gel de résolution en mélangeant 10 millilitres de solution de gel de résolution avec 60 microlitres de persulfate d’ammonium à 10 % fraîchement préparé dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de TEMED. Retournez doucement le tube 2 à 3 fois.
Ajoutez rapidement 10 millilitres de la solution de gel de polyacrylamide activé dans la cassette à l’aide d’une pipette. Superposez avec 2 millilitres d’eau filtrée désionisée et laissez le gel de résolution polymériser pendant 30 minutes.
Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jetez l’eau retrouvée. Coulez le gel d’empilage en mélangeant 3 millilitres de solution de gel d’empilage avec 90 microlitres de persulfate d’ammonium à 10 % fraîchement préparé dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 3 microlitres de TEMED, et retournez doucement le tube 2 à 3 fois.
À l’aide d’une pipette, ajoutez rapidement la solution de gel d’empilage sur le gel de résolution solidifié, jusqu’à ce que la cassette soit remplie à ras bord. Insérez complètement le peigne inclus avec la cassette de gel de polyacrylamide vide et laissez le gel d’empilage polymériser pendant 30 minutes. Une fois que le gel s’est polymérisé, retirez la bande de ruban adhésif du bas de la cassette et replacez la cassette dans l’ensemble du réservoir PAGE. Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec les solutions tampons respectives.
Dissoudre les échantillons de glycosaminoglycanes séchés dans le volume minimum nécessaire d’eau désionisée et filtrée, et mélanger avec le tampon de chargement d’échantillon dans un rapport de 1 pour 1. Chargez les échantillons et les échelles d’oligosaccharides HS dans le gel.
Refaites fonctionner le gel pendant 5 minutes à 100 volts. Ensuite, faites-le fonctionner à 200 volts pendant 20 à 100 minutes, selon le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel de résolution.