Dénaturation de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide d’urée pour l’analyse de l’ARN : une technique pour séparer les oligonucléotides d’ARN phosphorylé marqués par fluorescence de leurs équivalents non phosphorylés

Pour commencer, prélevez un échantillon contenant des oligonucléotides d’ARN phosphorylés et non phosphorylés marqués par fluorescence mélangés au colorant de charge contenant de l’urée. Chauffez l’échantillon.

L’urée - un puissant dénaturant - en combinaison avec la chaleur dénature la structure secondaire de l’ARN, ce qui entraîne sa conformation linéarisée et non structurée. Maintenant, coulez le gel en mélangeant une solution d’acrylamide-bisacrylamide avec de l’urée.

Ajoutez de la tétraméthylène diamine, un catalyseur, et du persulfate d’ammonium, un agent oxydant, pour faciliter la polymérisation ultérieure du gel.

Versez la solution dans un appareil à cassette pré-assemblé. Insérez un peigne et créez des puits pour le chargement de l’échantillon. Laissez le gel polymériser. Placez la cassette dans l’appareil à gel. Ajoutez un tampon de coulée aux réservoirs supérieur et inférieur, en maintenant le flux de courant à travers tout le gel. Retirez le peigne.

Chargez l’échantillon mélangé avec le colorant de visualisation dans le puits et connectez le gel à une alimentation électrique à la tension souhaitée. L’urée contenue dans le gel permet aux molécules d’ARN de migrer en tant qu’espèces linéaires.

Le gel agit comme un tamis, permettant aux molécules d’ARN chargées négativement de se déplacer à travers les pores vers l’électrode positive. Pendant l’exécution, l’ARN phosphorylé étant intrinsèquement plus négatif se déplace plus rapidement que l’ARN non phosphorylé.

Imagez le gel pour la détection de l’ARN marqué par fluorescence. Observez le changement de mobilité entre l’ARN phosphorylé qui migre plus rapidement, qui apparaît comme une bande inférieure par rapport à l’ARN non phosphorylé.

Pour préparer une solution de gel d’acrylamide dénaturant à 15 %, combinez 22,5 millilitres de solution pré-mélangée d’acrylamide/bis-acrylamide à 40 % 29:1, 6 millilitres de 10X TBE, 28,8 grammes d’urée et de l’eau sans RNase pour obtenir un volume total de 59 millilitres. Ensuite, remuez doucement la solution.

Faites chauffer la solution au micro-ondes pendant 20 secondes, remuez-la et remettez-la immédiatement au micro-ondes pendant encore 20 secondes. Remuez doucement la solution jusqu’à ce que l’urée soit complètement dissoute. Placez le bécher en verre dans un bain d’eau peu profond, contenant de l’eau froide, pendant 5 minutes, en vous assurant que le niveau d’eau froide entourant le bécher en verre est supérieur au niveau de solution à l’intérieur du bécher en verre. Lorsque la solution est froide, filtrez-la et dégazez-la à l’aide d’une unité de filtration jetable de 0,22 micromètre pour éliminer les particules et les bulles d’air microscopiques.

Lavez une assiette en verre courte et longue avec de l’eau et du savon. Ensuite, vaporisez chaque plaque avec de l’éthanol à 95 % et essuyez le verre pour éliminer toute humidité. Soulevez la longue plaque du dessus de la paillasse en la plaçant sur une boîte. Ensuite, positionnez des entretoises de 0,4 millimètre le long des bords longs de la plaque. Posez la plaque courte sur la plaque longue, en vous assurant que les bords de la plaque courte, de la plaque longue et des entretoises sont alignés. Ensuite, serrez chaque côté avec trois pinces métalliques régulièrement espacées.

Ajoutez 24 microlitres de TEMED à la solution d’acrylamide et mélangez-la. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de 10 % APS et versez immédiatement la solution entre les plaques de verre.

Verser la solution d’acrylamide entre le sandwich de plaque de verre peut être très difficile. Pour éviter les bulles d’air, tapotez le sandwich de la plaque de verre pendant que vous versez votre solution.

Soigneusement, ajoutez un peigne propre à 32 puits sur le dessus du sandwich de plaque de verre et laissez l’acrylamide polymériser pendant 30 minutes.

Pour faire fonctionner le gel, réglez le bloc de chaleur à 75 degrés Celsius, retirez les pinces métalliques et lavez et séchez soigneusement le sandwich de plaque de verre. Positionnez le sandwich de plaques dans l’appareil à gel avec la plaque courte vers l’avant, et préparez un tampon de fonctionnement 0,5X TBE en combinant 100 millilitres de TBE 10X avec 1,9 litre d’eau sans RNase.

Ajoutez 600 millilitres de tampon de fonctionnement dans les chambres supérieure et inférieure de l’appareil. Retirez délicatement le peigne du gel et rincez abondamment les puits avec une seringue. Pré-exécutez le gel à 50 watts pendant 30 minutes. Ensuite, rincez à nouveau les puits.

Faites tourner les réactions éteintes et incubez-les à 75 degrés Celsius pendant 3 minutes. Répétez le spin de l’impulsion et chargez immédiatement 10 microlitres de chaque échantillon sur le gel. Ensuite, faites fonctionner le gel pendant 3 heures à 50 watts. Une fois le fonctionnement terminé, coupez l’alimentation électrique et vidangez la chambre supérieure de l’appareil.

Lavez et séchez la face extérieure du sandwich en plaque de verre. Ensuite, couvrez-le d’une feuille d’aluminium et transférez-le sur un scanner laser pour l’imagerie. Montez le sandwich de plaque de verre sur la platine du scanner laser, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour le fluorophore souhaité et imagez le gel.