Dénaturation de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide d’urée pour l’analyse de l’ARN : une technique pour séparer les oligonucléotides d’ARN phosphorylé marqués par fluorescence de leurs équivalents non phosphorylés

Pour commencer, prélevez un échantillon contenant des oligonucléotides d’ARN phosphorylés et non phosphorylés marqués par fluorescence mélangés au colorant de charge contenant de l’urée. Chauffez l’échantillon.

L’urée - un puissant dénaturant - en combinaison avec la chaleur dénature la structure secondaire de l’ARN, ce qui entraîne sa conformation linéarisée et non structurée. Maintenant, coulez le gel en mélangeant une solution d’acrylamide-bisacrylamide avec de l’urée.

Ajoutez de la tétraméthylène diamine, un catalyseur, et du persulfate d’ammonium, un agent oxydant, pour faciliter la polymérisation ultérieure du gel.

Versez la solution dans un appareil à cassette pré-assemblé. Insérez un peigne et créez des puits pour le chargement de l’échantillon. Laissez le gel polymériser. Placez la cassette dans l’appareil à gel. Ajoutez un tampon de coulée aux réservoirs supérieur et inférieur, en maintenant le flux de courant à travers tout le gel. Retirez le peigne.

Chargez l’échantillon mélangé avec le colorant de visualisation dans le puits et connectez le gel à une alimentation électrique à la tension souhaitée. L’urée contenue dans le gel permet aux molécules d’ARN de migrer en tant