Électrophorèse bidimensionnelle semi-dénaturante sur gel d’agarose : une technique pour séparer les fibres amyloïdes polymorphes en fonction de l’hétérogénéité de taille

Les fibres amyloïdes sont des agrégats de protéines mal repliées, qui présentent une hétérogénéité de taille. Ces fibres, étant résistantes aux détergents anioniques tels que les SDS, peuvent être analysées par électrophorèse bidimensionnelle sur gel d’agarose semi-dénaturant.

Pour commencer, prenez un gel d’agarose pré-assemblé, de la taille d’un grand pore, qui contient des FDS. La porosité élevée permet la séparation des fibres intactes pendant le passage. Superposez le gel avec un tampon contenant une FDS.

Chargez un lysat cellulaire contenant des fibres amyloïdes dans le gel. La présence de SDS et l’absence d’étape de chauffage de l’échantillon créent des conditions de semi-dénaturation où le détergent se lie à des amyloïdes très résistants, conférant une charge négative uniforme aux fibres intactes.

Faites fonctionner le gel dans la première dimension à la tension appropriée. Le champ électrique provoque la migration des amyloïdes chargées négativement vers l’anode chargée positivement.

Au cours de l’exécution, les fibres plus petites migrent rapidement par rapport aux plus grandes, formant un motif de bande en forme de tache indiquant une hétérogénéité de taille.

Une fois terminé, faites pivoter le gel perpendiculairement et faites-le fonctionner dans la deuxième dimension. Dans cette dimension, les fibres se déplacent à l’identique à la première série en se séparant en fonction de leur taille. Cela crée un frottis diagonal car les fibres plus petites migrent plus rapidement que les plus grandes.

La formation de la bande diagonale aiguë confirme une population fibrillaire amyloïde intacte mais hétérogène.

Pour préparer le gel, ajoutez 2 grammes de poudre d’agarose à 200 millilitres de tampon TAE dans un bécher en verre. Ensuite, faites chauffer le bécher au micro-ondes pour faire fondre l’agarose.

Ensuite, ajoutez 1 millilitre de 20 % de SDS à une concentration finale de 0,1 %. Faites tourner doucement le bécher.

Ensuite, versez l’agarose liquide sur une plaque de gel de 15 cm x 14 cm. Pour éliminer les bulles d’air, utilisez une pipette de 1 millilitre. Ensuite, placez un peigne de 20 puits sur le gel.

Ensuite, ajoutez environ 60 microgrammes de lysat à cellules entières dans la voie la plus à droite du gel. Faites fonctionner le gel à 60 volts pendant environ quatre heures, en utilisant le tampon TAE contenant 0,1 % de SDS, comme tampon de fonctionnement.

Pour faire fonctionner le gel dans la deuxième dimension, faites pivoter soigneusement le gel de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Ensuite, faites fonctionner la prison à 60 volts pendant environ quatre heures.