Électrophorèse capillaire : une technique pour analyser les amplicons de réaction en chaîne par polymérase marqués par fluorescence

Pour déterminer la taille des fragments d’ADN à l’aide de l’électrophorèse capillaire, commencez par prendre une plaque de dosage multipuits. Chaque puits contient des amplicons PCR marqués par fluorescence et de tailles différentes - des oligonucléotides d’ADN double brin obtenus après un cycle de PCR.

Ajoutez quelques fragments d’ADN double brin de tailles différentes dans le puits, qui agissent comme une norme de taille. Chacune de ces molécules d’ADN porte une étiquette fluorescente pour une identification facile.

Complétez le puits avec du formamide, un dénaturant puissant, et chauffez à haute température. Cette étape dénature l’ADN, formant des fragments monocaténaires qui peuvent migrer facilement à travers les pores du gel.

Placez la plaque dans une unité d’analyse de fragments qui contient du gel polymère pré-injecté à l’intérieur de son système capillaire.

Appliquez une haute tension pour introduire électrocinétiquement l’ADN du puits dans le capillaire de faible diamètre au niveau de la cathode - l’extrémité négative. Les molécules d’ADN chargées négativement migrent vers l’anode chargée positivement. Les brins d’ADN les plus courts subissent moins de force de frottement