JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:29 min • July 8th, 2025
Pour déterminer la taille des fragments d’ADN à l’aide de l’électrophorèse capillaire, commencez par prendre une plaque de dosage multipuits. Chaque puits contient des amplicons PCR marqués par fluorescence et de tailles différentes - des oligonucléotides d’ADN double brin obtenus après un cycle de PCR.
Ajoutez quelques fragments d’ADN double brin de tailles différentes dans le puits, qui agissent comme une norme de taille. Chacune de ces molécules d’ADN porte une étiquette fluorescente pour une identification facile.
Complétez le puits avec du formamide, un dénaturant puissant, et chauffez à haute température. Cette étape dénature l’ADN, formant des fragments monocaténaires qui peuvent migrer facilement à travers les pores du gel.
Placez la plaque dans une unité d’analyse de fragments qui contient du gel polymère pré-injecté à l’intérieur de son système capillaire.
Appliquez une haute tension pour introduire électrocinétiquement l’ADN du puits dans le capillaire de faible diamètre au niveau de la cathode - l’extrémité négative. Les molécules d’ADN chargées négativement migrent vers l’anode chargée positivement. Les brins d’ADN les plus courts subissent moins de force de frottement et se déplacent plus rapidement à travers le gel que les brins d’ADN plus longs.
Lors de l’électromigration, l’ADN croise le chemin du faisceau laser, ce qui provoque la fluorescence du colorant. Les signaux d’émission du colorant sont capturés par un détecteur et sont ensuite traduits en un électrophérogramme - un graphique représentant chaque ADN fluorescent sous la forme d’un pic individuel de couleur différente.
Comparez le pic de fragment d’ADN inconnu avec les pics de référence pour analyser sa taille.
Après confirmation de la présence d’amplicons de PCR, utiliser des bandelettes ou des plaques de PCR neuves pour diluer les produits de PCR 1 à 10 dans de l’eau purifiée. Vortex et centrifugeuse brièvement. Pendant que vous travaillez dans une sorbonne, préparez un mélange principal dans un tube à centrifuger composé de formamide et d’une solution étalon de référence.
En fonction du nombre de produits PCR à analyser, utiliser les volumes de réactifs, comme détaillé dans le manuscrit. Prévoyez un surplus de volume de 10 %.
Vortex brièvement et distribuez 9,5 microlitres dans des puits individuels sur une plaque PCR, adaptée au système d’électrophorèse capillaire disponible. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitre de produit PCR dilué. Scellez et centrifugez brièvement.
Ensuite, chargez la plaque contenant les échantillons dans un thermocycleur PCR et dénaturez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 3 minutes, avant de refroidir à 4 degrés Celsius indéfiniment. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 minute. Retirez délicatement le joint et chargez la plaque sur un système d’électrophorèse capillaire calibré conformément aux instructions du fabricant.
Effectuez une analyse de fragments par électrophorèse capillaire à l’aide de réactifs adaptés à l’appareil de votre choix, et ajustez les conditions de fonctionnement en fonction de la description du manuscrit.