Électrophorèse capillaire microfluidique pour la taille des fragments de produits PCR : une technique de séparation électrophorétique basée sur une micropuce pour séparer les fragments d’ADN en fonction de leur taille

L’électrophorèse microfluidique est une technique permettant de séparer des fragments d’ADN de différentes tailles dans les microcapillaires.

Pour commencer, prenez une puce microfluidique multi-puits ayant des puits désignés pour le mélange de polymère à base de gel et de colorant fluorescent, des échantillons d’ADN et une échelle d’ADN de poids moléculaire connue. Ces puits sont interconnectés via un réseau de microcanaux.

Distribuez le mélange gel-colorant dans les puits alloués. Assemblez la puce sur une station d’amorçage pré-équipée d’une seringue vide. Appuyez sur le piston de la seringue, en appliquant une pression pour forcer le mélange gel-colorant dans le microcanal de séparation.

Retirez la puce et pipetez les autres composants dans leurs puits respectifs. Ajoutez un marqueur - un étalon interne qui étalonne le dimensionnement de l’échantillon - aux puits contenant l’échelle et les échantillons.

Insérez la micropuce dans un analyseur de fragments pour faire fonctionner la puce. Une fois à l’intérieur, la tension appliquée génère des forces électrophorétiques, conduisant l’échantillon du puits dans le microcanal de chargement de l’échantillon à partir duquel il atteint l’intersection transversale entre ce canal et le canal de séparation. Le courant électrique aide l’échantillon à entrer dans le microcanal de séparation.

Les molécules de colorant fluorescent intercalent des fragments d’ADN chargés négativement qui se déplacent vers l’anode à différentes vitesses électrophorétiques par rapport à leur taille moléculaire - les fragments plus petits migrant plus rapidement que les plus grands. Par conséquent, les fragments se séparent en bandes de différentes tailles qui deviennent fluorescentes.

Un détecteur laser mesure la fluorescence de chaque bande et l’enregistre sous la forme d’un électrophérogramme qui affiche un ADN de différentes tailles sous la forme d’un pic distinct.

Avant de commencer, apportez le concentré de colorant d’ADN, la matrice de gel d’ADN, le marqueur d’ADN, l’échelle d’ADN et les échantillons d’ADN purifié à température ambiante. Configurez la station d’amorçage en replaçant la seringue et en ajustant la plaque de base. Ensuite, relâchez le levier du clip de seringue et faites-le glisser en position haute.

Démarrez le logiciel de dimensionnement et préparez le mélange gel-colorant. Vortex le concentré de colorant pendant 10 secondes et faites-le tourner. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de colorant dans un flacon à matrice de gel et mélangez la solution.

Transférez le mélange gel-colorant dans un filtre d’essorage. Placez-le dans la centrifugeuse et faites-le tourner pendant 10 minutes à 1 500 fois g. Lorsque vous êtes prêt à charger le mélange gel-colorant, insérez une nouvelle puce à ADN dans la station d’amorçage et ajoutez 9 microlitres du mélange gel-colorant dans le puits marqué d’un « G ».

Fermez la station d’amorçage et assurez-vous que le piston est positionné au repère de 1 millilitre. Appuyez sur le piston de la seringue jusqu’à ce qu’il soit maintenu par le clip. Attendez exactement 30 secondes, puis relâchez le clip. Attendez 5 secondes de plus, puis ramenez lentement le piston à la position 1 millilitre.

Ouvrez la station d’amorçage et ajoutez 9 microlitres de mélange gel-colorant dans les puits marqués d’un « G ». Ajoutez 5 microlitres de marqueur dans le puits marqué d’un symbole d’échelle, et chacun des 12 puits d’échantillon.

Ajoutez 1 microlitre de l’échelle dans le puits avec le symbole de l’échelle, et 1 microlitre du produit PCR ou de l’eau dans les puits d’échantillons. Vortex la puce pendant 1 minute à 2 400 tr/min. Insérez-le dans le bioanalyseur et faites fonctionner la puce dans les cinq minutes.