FDS non réductrice PAGE : Méthode d’analyse des complexes protéiques multimériques liés au disulfure

Les protéines multimères sont stabilisées par des liaisons disulfures intermoléculaires, covalentes entre leurs résidus de cystéine, ce qui est crucial pour maintenir leur intégrité structurelle et fonctionnelle.

Pour analyser de tels complexes par PAGE non réducteur, prenez la concentration souhaitée de protéines stabilisées au disulfure. Ajoutez un tampon d’échantillon non réducteur et chauffez l’échantillon.

Ce tampon contient du SDS, qui confère une charge négative globale aux protéines, et un colorant de suivi pour visualiser leur mouvement dans le gel. Le tampon est dépourvu de tout agent réducteur, ce qui permet aux liaisons disulfure de rester intactes, ce qui facilite le développement du complexe multimérique.

Chargez les différents complexes dans des puits de gel de polyacrylamide du pourcentage souhaité, pré-assemblés dans un appareil de gel. Ajoutez une échelle protéique de taille connue dans un autre puits. Immergez les puits dans une mémoire tampon de fonctionnement basée sur SDS et connectez l’appareil à une alimentation électrique.

Le courant électrique force les complexes protéiques chargés négativement à se déplacer à travers les pores du gel vers l’anode - la borne positive. Étant donné que les complexes protéiques sont uniformément chargés négativement, la séparation se produit en fonction de la taille, où les multimères forment une bande de poids moléculaire plus élevée à une position spécifique.

Comparez la taille de la bande protéique séparée avec l’échelle. L’absence de bandes de poids moléculaire inférieur dans le gel confirme la séparation réussie des complexes multimériques intacts.

Préparez 1 litre de tampon de coulage 1X Tris-glycine en mélangeant 25 millimolaires de Tris, 192 millimolaires de glycine et 0,1 % poids par volume SDS. Ensuite, installez l’appareil de fonctionnement SDS-PAGE.

Ouvrez le boîtier TGX SDS-PAGE préfabriqué à 16 % selon le protocole du fabricant et retirez la cassette. Retirez le peigne qui tapisse les puits et le ruban adhésif du bas de la cassette, et placez le gel dans l’appareil en marche. Remplissez la chambre avec le tampon de coulée 1X, jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide.

À l’aide d’une pipette en plastique, rincez les puits avec le tampon courant. Chargez les échantillons sur le gel avec 10 microlitres du marqueur standard pré-coloré. Enfin, faites fonctionner le gel à 200 volts jusqu’à ce que la face du colorant soit à environ 1 centimètre du bas du gel.