Focalisation isoélectrique en phase liquide : une technique d’électrophorèse pour séparer les molécules bioactives de l’extrait brut de Gymnema sylvestre

Commencez avec une cellule IEF à focalisation isoélectrique pré-assemblée - une unité d’électrophorèse en phase liquide. Cette colonne est une chambre poreuse horizontale compartimentée avec des bornes positives et négatives distinctes aux extrémités.

Maintenant, prenez l’extrait de plante contenant un mélange complexe de composants chargés différemment avec des points isoélectriques variables, pI - un pH où la charge nette sur une molécule est nulle.

L’extrait est complété par des ampholytes de charges variables qui facilitent le fractionnement ultérieur des composants de l’échantillon.

Chargez l’échantillon dans les ports de chargement de la colonne. Actuellement, la colonne IEF a un pH constant. Ensuite, appliquez une haute tension pour initier l’électrophorèse.

Sous le champ électrique, les ampholytes solubles migrent vers des électrodes de charge opposée et établissent un gradient de pH linéaire à travers la colonne. Les composants de l’échantillon commencent à migrer à travers le gradient de pH de la phase liquide, et ceux positionnés à un pH inférieur à leur pI portent une charge positive nette.

Ceux-ci migrent vers l’électrode négative jusqu’à ce que les composants atteignent leur pI, où leur charge se neutralise et où la migration s’arrête. De même, les composants à un pH supérieur à leur pI migrent vers l’électrode positive et s’arrêtent lorsqu’ils atteignent leur pI. Cela sépare les composants de l’échantillon en fonction de leur pI dans des compartiments ciblés. Récoltez les fractions purifiées pour une analyse plus approfondie.

Ajoutez 0,6 gramme d’extrait de plante Gymnema sylvestre à 60 millilitres d’eau distillée. Dissoudre l’extrait de plante en le mélangeant dans un tube à rouleau pendant cinq minutes.

Pour éliminer les particules insolubles, centrifugez la solution à 10 000 x g pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un bécher en verre de 150 millilitres et ajoutez de l’ampholyte pour créer une solution à 1 % en volume, soit environ 0,6 millilitre.

À l’aide d’une seringue de 50 millilitres, munie d’une aiguille à bout émoussé de 1,5 pouce de calibre 19, chargez la solution dans la cellule IEF par les orifices de prélèvement d’échantillons. Ensuite, retirez la cellule du support et tapotez la chambre de l’électrode pour déloger et éliminer les bulles.

Connectez l’appareil à l’eau de refroidissement. Avec la puissance fournie à 15 watts constants, commencer le fractionnement. Faites fonctionner l’unité IEF jusqu’à ce que la tension atteigne une valeur constante, environ trois heures.

Après avoir appuyé sur le bouton Harvest ON, alignez les broches du collecteur de fractions avec les ports de collecte. Poussez les goupilles à travers le ruban d’étanchéité pour commencer à collecter les fractions de Gymnema sylvestre.