Électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide : technique de séparation pour l’analyse des protéines dans un mélange complexe de protéines basé sur la charge et la masse moléculaire

Pour l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle d’un mélange de protéines dérivé de tissu tumoral homogénéisé, traiter avec un tampon contenant des chaotropes, un détergent zwitterionique et un agent réducteur. Les chaotropes et les détergents dénaturent et solubilisent les protéines. Les agents réducteurs réduisent les liaisons disulfure des protéines, générant des groupes thiols libres et dépléchissant les protéines pour une résolution optimale des protéines.

Transvasez le mélange de protéines traitées dans un gradient de pH immobilisé, IPG, porte-bandelettes. Placez une bandelette IPG comprenant un gradient de pH linéaire dans la matrice de gel d’acrylamide. Ajoutez de l’huile minérale pour empêcher l’évaporation de la solution protéique. Transférez le support dans un système de mise au point isoélectrique, IEF. Laissez la solution protéique réhydrater la bandelette.

Effectuer l’IEF de première dimension. Le courant électrique fait migrer les protéines chargées à travers le gradient de pH vers des électrodes de charge opposée, s’immobilisant à leurs points isoélectriques respectifs - pH auquel les protéines ont une charge nette nulle.

Après l’IEF, traitez la bandelette IPG avec du dodécylsulfate de sodium, SDS, un détergent anionique qui confère une charge négative aux protéines. Equilibrez-vous avec un agent alkylant pour modifier les groupes thiols des protéines, assurant ainsi la solubilité des protéines lors de l’électrophorèse.

Chargez la bande sur un gel préfabriqué à petits pores résolvant le polyacrylamide et fixez-la avec de l’agarose fondue. Remplissez les chambres avec un tampon d’électrophorèse contenant du SDS. Initier l’électrophorèse de deuxième dimension, perpendiculairement à l’IEF.

Les protéines chargées négativement, de plus grand poids moléculaire, se déplacent lentement à travers le gel vers l’anode chargée positivement que les protéines plus petites, facilitant la séparation basée sur la taille.

Teignez le gel. Les protéines peuvent être visualisées sous forme de points discrets sur le gel.

Pour commencer cette procédure, ajoutez 250 microlitres d’une solution d’échantillon de protéines préalablement préparée dans chaque fente d’un porte-bandelette IPG de 13 centimètres. Placez une bande IPG de 18 centimètres, côté gel vers le bas, sur chaque solution d’échantillon de protéines, en prenant soin d’éviter les bulles. Ensuite, ajoutez 3 à 4 millilitres d’huile minérale pour recouvrir chaque bande IPG.

Ensuite, assemblez chaque support de bande IPG dans un système de mise au point isoélectrique, avec l’extrémité pointue sur la plaque arrière et l’extrémité carrée sur la plaque avant. Après avoir réhydraté les bandes IPG pendant 18 heures à température ambiante, réglez les paramètres IEF sur le système de mise au point isoélectrique avec une autonomie totale de 7,5 heures et 36 875 volts-heures.

Après l’IEF, retirez chaque bande IPG du système de mise au point isoélectrique et retirez l’excès d’huile minérale avec une serviette en papier insoluble. Ensuite, enveloppez chaque bande dans une feuille de pellicule plastique et conservez-la à -80 degrés Celsius.

Pour couler un gel PAGE à 12 %, ajoutez de l’eau doublement distillée, un tampon tris-chlorhydrique 1,5 molaire, une solution mère d’acrylamide/bisacrylamide à 40 %, du persulfate d’ammonium à 10 % et TEMED dans un bécher. Mélangez doucement la solution gélifiée en prenant soin d’éviter les bulles.

Versez doucement la solution de gel dans une chambre de coulée multiple, jusqu’à la hauteur de gel attendue de 19 centimètres. Ajoutez immédiatement environ 3 millilitres d’eau doublement distillée dans la chambre de coulée multiple pour couvrir chaque gel de résolution, et laissez chaque gel polymériser pendant environ une heure.

Cette étape est très importante pour préparer un gel SDS-PAGE de haute qualité. Un volume égal d’eau doit être immédiatement ajouté sur le dessus de chaque gel.

Préparez deux litres de tampon d’électrophorèse, puis ajoutez le tampon dans un réservoir tampon d’unité de séparation d’électrophorèse.

Après avoir sorti les bandes IPG focalisées du congélateur, placez-les dans un récipient en plastique contenant 1 millilitre de tampon d’équilibre réducteur et une trace de bleu de bromophénol, et équilibrez-les pendant 10 minutes en les balançant doucement. Après avoir retiré le tampon d’équilibre réducteur, ajoutez 4 millilitres de tampon d’équilibre d’alkylation et une trace de bleu de bromophénol aux bandes IPG, et équilibrez-les pendant 10 minutes en les balançant doucement.

Pendant l’équilibre du gel, démontez la chambre de coulée multiple et retirez la cassette de gel de résolution préparée. Rincez la cassette de gel trois fois avec de l’eau doublement distillée, puis retirez l’excès d’eau de la cassette de gel avec une serviette en papier insoluble et placez-la dans un support de gel.

Ensuite, rincez les bandes IPG équilibrées avec un tampon d’électrophorèse et éliminez l’excès de liquide sur chaque surface de bande IPG avec une serviette en papier insoluble. Placez une bande IPG sur le gel SDS-PAGE de résolution, en laissant le côté en plastique de la bande IPG entrer en contact avec la plaque de verre plus longue, avec l’extrémité pointue vers la gauche.

Maintenant, ajoutez rapidement 3 à 4 millilitres d’agarose chaud à 1 % et de tampon d’électrophorèse SDS, pour sceller la bande IPG sur le dessus de chaque gel SDS-PAGE, et placez la face supérieure de la bande IPG sur le dessus de la plaque de verre plus courte, en prenant soin d’éviter les bulles.

Ces étapes sont très importantes pour sceller la bande IPG sur un gel SDS-PAGE. Les solutions d’agarose chaude doivent être ajoutées immédiatement, et la bande IPG doit être immédiatement placée dans le haut du gel SDS.

Après la polymérisation, insérez la cassette de gel assemblée verticalement entre les joints en plastique et un système d’électrophorèse vertical. Placez le haut du gel avec la bande IPG à côté de la cathode. Ensuite, ajustez le niveau du tampon d’électrophorèse pour immerger la cassette de gel en ajoutant le volume approprié de tampon au système d’électrophorèse.

Connectez et réglez l’alimentation en mode tension constante et faites fonctionner à 200 volts pendant environ 370 minutes tout en surveillant le colorant. Une fois la course terminée, retirez la cassette de gel du système d’électrophorèse et retirez délicatement le gel de la cassette de gel, en prenant soin d’éviter de déchirer le gel.