Électrophorèse sur gel zymographique : une technique électrophorétique pour détecter les métalloprotéinases matricielles en évaluant l’activité enzymatique

La métalloprotéinase matricielle, ou MMP, une protéase multidomaine comprenant des domaines propeptides et catalytiques, est sécrétée sous forme d’enzyme inactive ou de zymogène par des cellules spécifiques. L’interaction entre l’ion zinc du domaine catalytique et le résidu cystéine du domaine propeptide maintient le MMP inactif.

Pour détecter les MMP dans le surnageant de culture cellulaire par électrophorèse sur gel de zymographie, remplissez le réservoir d’électrophorèse contenant la cassette de gel avec du dodécylsulfate de sodium ou un tampon de coulage contenant du SDS.

Chargez le surnageant de culture mélangé à un tampon de chargement, suivi d’étalons protéiques, dans des puits de gel de polyacrylamide, copolymérisé avec un substrat protéique spécifique du MMP.

Le SDS, un détergent chargé négativement, dans des conditions non réductrices, perturbe les interactions cystéine-zinc dans les MMP et dénature les protéines tout en leur conférant une charge négative.

Effectuez une électrophorèse. Le champ électrique fait migrer les protéines chargées négativement vers l’anode chargée positivement, provoquant une séparation des protéines en fonction de la taille.

Après l’électrophorèse, traitez le gel avec un tampon renaturant contenant un détergent non ionique. Les détergents non ioniques remplacent les SDS, renaturant les protéines et restaurant partiellement l’activité MMP. Les MMP sont ensuite traités jusqu’à un état entièrement actif.

Incuber dans un tampon en développement contenant des cations métalliques divalents essentiels à l’activité MMP. Les MMP actifs, ainsi que les cations, digèrent le substrat MMP dans le gel. Lavez le gel pour enlever les produits digérés. Teignez le gel.

Les zones d’activité de la MMP, dépourvues de substrat de la MMP, apparaissent sous forme de bandes claires sur un fond bleu foncé de substrat non digéré. À l’aide d’un logiciel approprié, l’intensité de la bande de gel peut être corrélée à l’activité MMP.

Avant le début de ce protocole, préparez toutes les métalloprotéinases matricielles, ou MMP, de manière adéquate pour maintenir la fonction des enzymes. Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou stockés à -80 degrés Celsius. Ici, la MMP-2, également connue sous le nom de gélatinase A ou de collagénase de type IV, est utilisée pour démontrer la visualisation de l’activité de la MMP par zymographie.

Une fois les enzymes MMP préparées, obtenir un sachet de gel zymogramme de gélatine à 10 % contenant un gel à l’intérieur d’une cassette. Rincez la cassette à l’eau déminéralisée. Retirez le ruban de protection du bas de la cassette et le peigne du haut du gel. Rincez les puits trois fois avec le tampon courant Tris-Glycine SDS.

Placez le gel dans un appareil d’électrophorèse à mini-cellule, en veillant à ce que le plus petit côté de la cassette soit tourné vers l’intérieur. Verrouillez le gel en place avec la cale de tension de gel. Remplissez la chambre supérieure de l’appareil avec le tampon courant Tris-Glycine SDS au-dessus du niveau des puits et vérifiez qu’il n’y a pas de fuites. Remplissez également la chambre inférieure de l’installation d’électrophorèse sur gel avec un tampon de coulée.

Ensuite, chargez 10 microlitres de marqueur moléculaire protéique.

Mélangez une quantité égale de l’échantillon à un tampon de chargement de gel qui ne contient pas d’agents réducteurs. Contrairement au SDS-PAGE ordinaire, ne faites pas bouillir les échantillons, mais chargez-les directement dans les puits du gel, à l’aide d’embouts de chargement de gel. Ces puits peuvent contenir jusqu’à 20 microlitres de volume.

Placez le couvercle sur la mini-cellule et connectez les cordons d’électrodes à l’alimentation électrique. Allumez l’alimentation électrique et réglez le gel pour qu’il fonctionne à 125 volts, constant pendant 90 minutes. Vérifiez la formation de petites bulles sur le fil de la chambre inférieure, indiquant la circulation du courant.

Lors de l’exécution du premier gel, surveillez la progression de la migration toutes les 15 minutes, en utilisant le bleu de bromophénol inclus dans le tampon de chargement comme indicateur. Pour chaque gel, préparez 100 millilitres de tampon de renaturation de zymogramme 1X et 200 millilitres de tampon de développement de zymogramme, tous deux dans de l’eau désionisée.

Lorsque le colorant de suivi bleu de bromophénol atteint le bas du gel, coupez l’alimentation.

Ouvrez la mini-cellule et retirez le gel. Séparez les deux côtés de la cassette à l’aide d’un couteau à gel. Coupez un coin pour marquer la direction du gel. Retirez délicatement le gel de la cassette et placez-le dans un récipient contenant 100 millilitres de tampon de renaturation.

Incuber le gel pendant 30 minutes à température ambiante en agitant doucement.

Retirez le tampon renaturant et ajoutez 100 millilitres de tampon de développement au gel. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante avec une agitation douce.

Ensuite, retirez le tampon de développement et ajoutez 100 millilitres supplémentaires de tampon de développement frais au gel. Incuber le gel pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Après une nuit d’incubation, retirez le tampon en développement et lavez le gel en l’incubant avec de l’eau déminéralisée, sous une légère agitation, pendant 5 minutes à température ambiante. Répétez ce lavage deux fois.

Placez le gel sur une feuille de plastique protectrice et retirez les bulles. Ensuite, scannez le gel avec un photo-scanner pour enregistrer le positionnement exact des bandes étalons de protéines, car elles deviendront à peine visibles après la coloration du gel.

Teignez le gel en ajoutant 20 millilitres de SimplyBlue SafeStain au gel. Incuber le gel pendant 1 heure à température ambiante, sous une légère agitation.

Retirez le SimplyBlue SafeStain, et décolorez le gel dans 100 millilitres d’eau déminéralisée à température ambiante en l’agitant doucement.

Après 1 heure, remplacez-le par de l’eau fraîche déminéralisée et continuez à incuber le gel pendant au moins une heure.