Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:16 min • July 8th, 2025
Les phospholipides sont des lipides complexes contenant des groupes phosphate. Ces molécules sont hydrolysées par une enzyme appelée phospholipase.
Pour effectuer le dosage de l’activité de la phospholipase, prenez une émulsion de jaune d’œuf riche en phospholipides, qui agissent comme substrat pour l’enzyme. Ajoutez le jaune à une solution chaude d’agarose contenant du chlorure de sodium, ce qui améliore la stabilité des protéines du jaune d’œuf au cours des étapes suivantes.
Complétez le mélange avec du chlorure de calcium et un colorant fluorescent - rhodamine. Versez le mélange dans une plaque de Pétri. Lors de la solidification, les phospholipides vitellins restent répartis de manière homogène dans la matrice de gel d’agarose.
À l’aide d’un tube, créez des puits correctement espacés dans le gel. Ajouter des concentrations variables d’extrait de protéines brutes contenant de la phospholipase dans les puits. Incuber la plaque à température physiologique.
La phospholipase de l’extrait se diffuse radialement dans le gel. Les ions calcium contenus dans le gel se lient à la phospholipase, activant les enzymes. Cette enzyme clive les phospholipides, générant des acides gras libres. Les molécules de rhodamine contenues dans le gel forment un complexe avec les acides gras libérés.
Lors de l’éclairage à la lumière ultraviolette, observez l’apparition de halos fluorescents autour des puits. Le halo confirme la présence d’une activité enzymatique. Avec des concentrations plus élevées de phospholipase, les molécules enzymatiques diffusent davantage, augmentant le diamètre du halo.
Lavez un œuf de poule avec 1 % de SDS dans de l’eau distillée et séparez le jaune d’œuf du blanc d’œuf dans des conditions stériles.
Préparez les solutions A, B, C et D. Ajoutez 500 microlitres de solutions A et C à la solution B et 100 microlitres de solution D. Mélangez-les et versez 25 millilitres dans chaque boîte de Pétri. Attendez que la solution se solidifie dans des conditions stériles et faites des puits d’environ 2 à 3 millimètres de diamètre, avec un tube mince.
Ajoutez un total de 20 microlitres de tampon phosphate comme témoin négatif dans un puits, et 20 microlitres d’une phospholipase déterminée comme témoin positif dans un autre puits.
Placez différentes quantités de protéines d’extrait brut - 5, 15, 25, 35 et 45 microgrammes dans les puits restants, chacun dans un volume final de 20 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 heures.