Essai de chiralité cellulaire en forme d’anneau : une technique in vitro pour déterminer la chiralité multicellulaire basée sur l’alignement cellulaire sur des micromotifs en forme d’anneau

Pour déterminer in vitro la chiralité des cellules de mammifères - le biais gauche-droite des cellules pour s’aligner dans une orientation vers la gauche ou vers la droite dans des conditions de confinement - commencez par des lames recouvertes d’or fabriquées sur mesure dans une plaque multipuits contenant un support. Les lames comprennent des micromotifs d’îlots en forme d’anneau de fibronectine favorisant l’adhésion cellulaire, remplis d’une monocouche auto-assemblée résistante à l’adhésion cellulaire.

Ensuite, ensemencez un volume approprié de suspension de cellules de mammifères sur les lames et incuberez. Les cellules s’adsorbent sur les micromotifs de l’anneau contenant la fibronectine. La monocouche auto-assemblée environnante empêche la fixation de cellules non spécifiques en dehors des limites de l’anneau.

Remplacez le support, en retirant toutes les cellules non attachées, par un support frais. Ajoutez un médicament interférant avec l’actine à un ensemble de lames et incuber.

Les cellules adhérentes prolifèrent, s’étendent et prennent la forme des îlots de fibronectine sous-jacents, tout en réorganisant leurs fibres d’actine en réponse aux signaux spatiaux, qui confinent la monocouche cellulaire, favorisant ainsi l’alignement biaisé.

Maintenant, traitez les lames avec du paraformaldéhyde pour la fixation cellulaire. Sous la microscopie à contraste de phase, les cellules des micromotifs de l’anneau apparaissent comme des régions sombres avec des contours brillants alignés en fonction de leur biais préférentiel.

À l’aide d’un logiciel, calculez l’angle d’alignement de chaque cellule comme l’écart par rapport à la direction circonférentielle de l’anneau. Moyenne pour déterminer la chiralité des cellules de mammifères. Les cellules traitées par des médicaments interférents avec l’actine peuvent présenter une chiralité inverse.

Avant d’ensemencer les cellules, réchauffez le substrat et la trypsine dans un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius.

Pour une meilleure fixation des cellules, faites tremper la lame à motifs dans une plaque à 12 puits contenant un milieu de culture et réchauffez-la à 37 degrés Celsius dans l’incubateur. Une fois que les cellules sont trypsinisées, neutralisez-les avec des milieux contenant du FBS. Réduisez les cellules à 100 x g pendant 3 minutes, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais. Comptez les cellules et diluez la suspension cellulaire pour atteindre la concentration de 200 000 cellules par millilitre.

Ajoutez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits contenant une lame d’or. Secouez doucement la plaque plusieurs fois pour un ensemencement cellulaire uniforme, avant de l’incuber pendant 15 minutes pour la fixation des cellules. Après 15 minutes, vérifiez la fixation de la cellule au microscope et, si nécessaire, incubez pendant un certain temps supplémentaire.

Une fois les cellules fixées, aspirez le milieu contenant les cellules non attachées de chaque puits et ajoutez 1 millilitre de milieu de culture frais. Cultivez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures et vérifiez la confluence pour déterminer si une chiralité s’est formée.

Lorsque la confluence requise est atteinte, fixez les cellules en retirant le milieu de culture. Après avoir rincé une fois avec du PBS, ajoutez une solution de paraformaldéhyde à 4 % sur la lame et incubez à température ambiante pendant 15 minutes, avant de rincer à nouveau avec du PBS trois fois.

Pour acquérir les images, utilisez un microscope à contraste de phase avec fonction de caméra et capturez chaque anneau de la lame à haute résolution.

Pour la caractérisation de la chiralité, téléchargez les fichiers de code MATLAB. Ajoutez le dossier de code et les sous-dossiers au chemin d’accès MATLAB et ouvrez le fichier « ROI_selection.m ». À la ligne 4, remplacez le répertoire par le dossier de données souhaité.

Modifiez la taille de l’image à la ligne 14, les deux premiers chiffres représentant la taille du cercle intérieur de l’anneau, tandis que les deux autres représentent l’extérieur.

Pour déterminer la région d’intérêt ou le retour sur investissement dans les images à contraste de phase, exécutez le code MATLAB « ROI_selection.m » m en cliquant sur le bouton Exécuter. Faites glisser manuellement le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau, puis double-cliquez sur l’image pour confirmer la sélection.

Après avoir sélectionné le retour sur investissement de toutes les images du dossier, un fichier « .mat » sera généré pour stocker les informations sur le retour sur investissement de chaque image. Ensuite, ouvrez le fichier « Analysis_batch.m » et changez le répertoire du dossier comme indiqué précédemment. Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code « Analysis_batch.m » afin de déterminer la chiralité de plusieurs modèles d’anneaux cellulaires.

Un fichier « datatoexcel.txt » sera généré, contenant des statistiques circulaires pour chaque anneau, ainsi que les numéros des anneaux dans le sens des aiguilles d’une montre, non chiraux et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.