Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:44 min • July 8th, 2025
Dans les mitochondries, la citrate synthase, localisée dans la matrice de la membrane mitochondriale interne, est l’enzyme limitant le taux qui catalyse la réaction entre l’acétylcoenzyme A et l’acide oxaloacétique pour former le citrate, la première étape du cycle de l’acide citrique.
Pour analyser l’activité de la citrate synthase, transférez les thorax des mouches drosophiles adultes abondants en mitochondries dans un tube rempli d’un tampon d’extraction réfrigéré contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique, de l’EDTA et un détergent non ionique.
Homogénéiser les tissus du thorax sur de la glace pour prévenir la dénaturation des protéines induite par la chaleur. La force de cisaillement appliquée, en conjonction avec les détergents, lyse les tissus et libère des composants intracellulaires, y compris les mitochondries.
De plus, la rupture de la membrane mitochondriale interne entraîne la libération de protéines de la matrice mitochondriale, y compris la citrate synthase. L’EDTA se lie aux cations divalents et inhibe l’activité de la protéase, empêchant ainsi la dégradation des protéines.
Diluer l’homogénat à l’aide d’un tampon d’extraction et ajouter un volume approprié dans le mélange réactionnel contenant les puits de la plaque multipuits. Le mélange réactionnel comprend de l’acétylcoenzyme A, de l’acide oxaloacétique et de l’acide dithionitrobenzoïque.
La citrate synthase dans l’homogénat catalyse la réaction entre l’acide oxaloacétique et l’acétylcoenzyme A, formant le citrate et la coenzyme A avec un groupe thiol. Le groupe thiol réagit avec l’acide dithionitrobenzoïque incolore, formant un produit jaune, l’acide thionitrobenzoïque.
À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance de la solution de couleur jaune. L’absorbance pourrait être liée à l’activité de la citrate synthase dans l’homogénat tissulaire.
Transférez immédiatement 10 thorax de mouches adultes dans 100 microlitres de tampon d’extraction glacé et homogénéisez-les avec un pilon sur glace. Gardez les échantillons froids en les homogénéisant pendant cinq à 10 secondes sur de la glace, en les laissant reposer sur de la glace pendant cinq secondes, puis en répétant l’opération jusqu’à ce que tous les tissus soient complètement homogénéisés.
Aliquote 10 microlitres de chaque échantillon homogénéisé dans un nouveau tube pour la mesure de la teneur en protéines, en maintenant également ces tubes sur de la glace. Ajoutez 400 microlitres de tampon d’extraction glacé à chaque échantillon restant pour un volume total de 500 microlitres, et pipetez doucement de haut en bas pour mélanger.
Pour chaque réaction, ajoutez 1 microlitre de lysat cellulaire dilué à 150 microlitres de la solution réactionnelle fraîchement préparée. Mélangez soigneusement en pipetant doucement, en veillant à éviter la formation de bulles. Ensuite, à l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’absorbance à 412 nanomètres toutes les 10 à 30 secondes pendant quatre minutes à 25 degrés Celsius.
Tracez les données sous forme d’absorbance dans le temps, puis calculez la pente de la partie linéaire de la courbe. Enfin, divisez la vitesse ou la pente de la réaction par la concentration en protéines de l’échantillon pour normaliser l’activité de la citrate synthase.