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Techniques biologiques
0 vues • 3:03 min • July 8th, 2025
Dans les tissus, le fer, un minéral essentiel crucial pour divers processus métaboliques, existe normalement séquestré dans les hémoprotéines et les protéines de fer non héminiques. Les hémoprotéines comprennent du fer ferreux ou héminique lié à des cycles de porphyrine, tandis que les protéines de fer non héminique n’ont pas la structure du cycle de porphyrine et comprennent principalement du fer ferrique ou non héminique.
Pour estimer la teneur en fer non héminique dans le tissu hépatique de souris, traiter un fragment de tissu hépatique de souris séché et récolté avec de faibles concentrations d’acide chlorhydrique et d’acide trichloracétique. Incuber à haute température pour digérer le tissu et faciliter la précipitation des protéines induites par l’acide.
En raison des faibles concentrations d’acide, le fer non héminique est libéré des protéines associées. Le fer héminique, lié au cycle porphyrine, reste intact.
Après refroidissement, transférez le volume souhaité de surnageant contenant du fer non héminique dans une plaque à plusieurs puits. Ajouter le chélateur de fer chromogène, le bathophénanthroline sulfonate, BPS, complété par de l’acide thioglycolique, un agent réducteur, dans un tampon approprié et incuber.
L’acide thioglycolique réduit tout le fer ferrique non héminique en fer ferreux, qui peut facilement se lier au BPS dans un rapport de 1:3, formant un complexe très stable de couleur rose. De plus, l’acide thioglycolique empêche les interférences dues à tout cation métallique divalent contaminant tel que le cuivre qui peut interagir avec le BPS.
Placez la plaque multi-puits dans un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance des complexes ferreux-BPS roses, représentatifs de la concentration en fer non héminique dans un fragment de tissu hépatique de souris.
Transférez chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 1 millilitre du mélange acide dans le tube et fermez-le. Préparez un blanc d’acide de la même manière, sauf que le tissu est omis ici.
Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant 20 heures pour digérer le tissu.
Après refroidissement à température ambiante, utilisez une micropipette équipée d’embouts en plastique pour transférer 500 microlitres d’extrait acide clair dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Préparez les réactions chromogènes directement dans les microplaques de polystyrène à fond plat, transparentes et non traitées, à 96 puits. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
Mesurez l’absorbance d’un échantillon dans un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nanomètres par rapport à une référence d’eau désionisée.