Dosage de l’oxydation du substrat dans les cellules en culture : un dosage in vitro pour quantifier l’oxydation du substrat dans les cellules en mesurant les signaux radioactifs du CO2 piégé
JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:25 min • July 8th, 2025
Dans les cellules métaboliquement actives, les substrats contenant du carbone sont oxydés par une série de réactions biochimiques pour générer de l’énergie et libérer du dioxyde de carbone comme sous-produit.
Pour déterminer le taux d’oxydation du substrat, commencez par une culture adhérente des cellules indifférenciées souhaitées. Complétez les cellules dans un milieu avec un substrat approprié contenant du carbone radioactif quatorze dans son épine dorsale, et incubez.
Les cellules consomment le substrat et l’oxydent pour libérer du dioxyde de carbone radiomarqué, qui se diffuse hors des cellules dans le milieu environnant.
Transférez ce milieu dans un ensemble de piégeage de gaz contenant de l’acide perchlorique pour éteindre la réaction. Ce tube contient un papier filtre imbibé d’hydroxyde de sodium installé à l’intérieur du capuchon du tube. Fermez le capuchon et incuberez.
Pendant l’incubation, le dioxyde de carbone, sous sa forme gazeuse, est libéré à l’intérieur du tube. L’hydroxyde de sodium absorbe le dioxyde de carbone radiomarqué, l’emprisonnant dans le papier filtre. Transférez ce papier filtre dans un flacon contenant un cocktail à scintillation et placez-le à l’intérieur du compteur à scintillation liquide.
À l’intérieur du compteur, le carbone radiomarqué subit une désintégration radioactive, émettant des particules bêta de haute énergie. Ces particules sont absorbées par les composants du cocktail de scintillation et émettent des impulsions lumineuses, qui sont calculées par le compteur de scintillation.
La quantité de radioactivité détectée est corrélée au taux d’oxydation du substrat dans les cellules.
Lavez les cellules dans les puits supplémentaires, deux fois avec du DPBS. Dissocier les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Remettez en suspension 20 microlitres de cellules digérées dans le DPBS avec 20 microlitres de solution de colorant d’orange d’acridine et d’iodure de propidium. Déterminez le nombre de cellules actives à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre.
Lavez les cellules dans les puits de dosage deux fois avec du DPBS. Ajoutez 500 microlitres de milieu chaud à chaque puits de test dans le capot de culture tissulaire désigné par RAM. Après avoir scellé la plaque avec du parafilm, incubez les cellules dans un incubateur désigné par RAM à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.
Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires légèrement plus grands que la surface à l’intérieur du capuchon du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et insérez le papier bien ajusté dans le bouchon. Ajoutez 200 microlitres d’acide perchlorique 1 molaire dans chaque tube et 20 microlitres d’hydroxyde de sodium dans le papier filtre installé à l’intérieur du bouchon.
Après l’incubation des cellules, transférez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits dans les tubes préparés et fermez immédiatement les bouchons. Laissez les tubes dans un support à tubes à température ambiante pendant 1 heure.
Parallèlement, pendant l’incubation, installez un flacon à scintillation pour chaque tube et remplissez-le de 4 millilitres de liquide à scintillation. Transférez chaque morceau de papier filtre dans un flacon à scintillation et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.
Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie, le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour détecter une contamination potentielle par RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons à scintillation contenant du liquide à scintillation.
Mesurez la radioactivité du carbone 14 dans les flacons à scintillation à l’aide d’un compteur à scintillation et enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail conformément aux directives de radioprotection, si nécessaire.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de mesurer le taux d'oxydation du substrat dans des cellules métaboliquement actives à l'aide de carbone-14 radiomarqué. Le processus consiste à incuber les cellules avec un substrat radioactif et à quantifier la production de dioxyde de carbone résultante.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Biologie cellulaire
- Analyse métabolique
Contexte
- La compréhension de l'oxydation des substrats est essentielle pour l'étude du métabolisme cellulaire.
- Le dioxyde de carbone est un produit secondaire de la respiration cellulaire.
- Le marquage radioactif permet une mesure précise des processus métaboliques.
- Une quantification précise de la radioactivité peut indiquer les taux métaboliques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour mesurer les taux d'oxydation des substrats dans les cellules.
- Utiliser le carbone-14 comme traceur dans les études métaboliques.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de production d'énergie cellulaire.
Méthodes utilisées
- Les cellules sont cultivées et supplémentées avec un substrat radioactif.
- Le dioxyde de carbone produit est piégé à l'aide d'hydroxyde de sodium.
- L'activité radioactive est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation.
- La viabilité cellulaire est évaluée par coloration à l'orange d'acridine et à l'iodure de propidium.
Résultats principaux
- La méthode quantifie avec succès le taux d'oxydation du substrat.
- Les niveaux de radioactivité sont corrélés à l'activité métabolique dans les cellules.
- La viabilité cellulaire reste intacte pendant le processus de mesure.
- Les résultats démontrent l'efficacité de l'utilisation du carbone-14 pour les études métaboliques.
Conclusions
- Cette méthode fournit un outil précieux pour l'étude du métabolisme cellulaire.
- L'utilisation de substrats radiomarqués peut améliorer la précision des recherches métaboliques.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette technique pour explorer diverses voies métaboliques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La quantification de l'oxydation des substrats fournit une mesure directe du flux métabolique cellulaire, permettant la validation de cibles dans les voies d'homéostasie énergétique. Ce dosage permet une détection mécanistique des risques en reliant l'utilisation du substrat à des états physiopathologiques dans des systèmes pertinents pour la maladie. La méthode de piégeage du CO2 radiomarqué fournit des données quantitatives et reproductibles, offrant une confiance prédictive dans les phases précoces de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge les hypothèses thérapeutiques en mesurant le flux à travers des voies spécifiques d'oxydation des substrats.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles métaboliques par mesure directe de l'activité des voies.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en corrélant les taux d'oxydation des substrats avec les phénotypes métaboliques cellulaires.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes cellulaires validés pour le criblage de composés en aval en établissant une activité métabolique de base.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats quantitatifs normalisés par comptage scintillation du 14CO2 piégé.
- Valeur en termes de reproductibilité : Permet la réutilisation du test pour plusieurs substrats et conditions avec une détection de signal constante.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Maintient la continuité entre la découverte et les modèles précliniques en mesurant des produits métaboliques conservés.
- Déminimisation du risque mécanistique : Précise les contributions spécifiques aux voies de production d'énergie, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant le mécanisme ciblé.
- Progression ajustée au risque : Guide les décisions d'aller ou de ne pas aller en quantifiant la vulnérabilité métabolique ou l'adaptation dans des cellules pertinentes pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cet essai s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de l'hypothèse sur la cible à l'optimisation du composé, en fournissant des données de phénotypage métabolique qui renseignent sur les effets du composé sur les voies énergétiques cellulaires.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant le flux à travers des substrats carbonés spécifiques afin de clarifier l'engagement des voies métaboliques.
- Triage : Fournit des lectures métaboliques reproductibles et prêtes à l'emploi pour évaluer les modifications induites par des composés dans l'utilisation des substrats.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives de radioactivité permettant la comparaison des états métaboliques entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en mesurant la production conservée de CO2 comme indicateur fonctionnel de l'activité mitochondriale.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme reconfigurable de phénotypage métabolique applicable à plusieurs projets et classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la mesure directe du flux métabolique.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité par le piégeage standardisé et la détection par scintillation du CO2 radiomarqué.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une détection précoce des risques métaboliques associés aux cibles.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en identifiant les composés qui modulent l'oxydation des substrats dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des radio-isotopes et dans les protocoles de sécurité liés aux rayonnements.
- Dépend de l'infrastructure de comptage par scintillation et de la disponibilité du substrat marqué au 14C.
- Exige une standardisation de la densité cellulaire et des durées d'incubation pour obtenir des résultats comparables.
- Requiert une adaptation pour les cellules non adhérentes ou les cellules primaires, en utilisant des étapes de dissociation modifiées.
- Limité par la nécessité d'une licence pour les matières radioactives et la conformité aux exigences d'élimination des déchets.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026