Dosage de l’oxydation du substrat dans les cellules en culture : un dosage in vitro pour quantifier l’oxydation du substrat dans les cellules en mesurant les signaux radioactifs du CO₂ piégé

Dans les cellules métaboliquement actives, les substrats contenant du carbone sont oxydés par une série de réactions biochimiques pour générer de l’énergie et libérer du dioxyde de carbone comme sous-produit.

Pour déterminer le taux d’oxydation du substrat, commencez par une culture adhérente des cellules indifférenciées souhaitées. Complétez les cellules dans un milieu avec un substrat approprié contenant du carbone radioactif quatorze dans son épine dorsale, et incubez.

Les cellules consomment le substrat et l’oxydent pour libérer du dioxyde de carbone radiomarqué, qui se diffuse hors des cellules dans le milieu environnant.

Transférez ce milieu dans un ensemble de piégeage de gaz contenant de l’acide perchlorique pour éteindre la réaction. Ce tube contient un papier filtre imbibé d’hydroxyde de sodium installé à l’intérieur du capuchon du tube. Fermez le capuchon et incuberez.

Pendant l’incubation, le dioxyde de carbone, sous sa forme gazeuse, est libéré à l’intérieur du tube. L’hydroxyde de sodium absorbe le dioxyde de carbone radiomarqué, l’emprisonnant dans le papier filtre. Transférez ce papier filtre dans un flacon contenant un cocktail à scintillation et placez-le à l’intérieur du compteur à scintillation liquide.

À l’intérieur du compteur, le carbone radiomarqué subit une désintégration radioactive, émettant des particules bêta de haute énergie. Ces particules sont absorbées par les composants du cocktail de scintillation et émettent des impulsions lumineuses, qui sont calculées par le compteur de scintillation.

La quantité de radioactivité détectée est corrélée au taux d’oxydation du substrat dans les cellules.

Lavez les cellules dans les puits supplémentaires, deux fois avec du DPBS. Dissocier les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Remettez en suspension 20 microlitres de cellules digérées dans le DPBS avec 20 microlitres de solution de colorant d’orange d’acridine et d’iodure de propidium. Déterminez le nombre de cellules actives à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre.

Lavez les cellules dans les puits de dosage deux fois avec du DPBS. Ajoutez 500 microlitres de milieu chaud à chaque puits de test dans le capot de culture tissulaire désigné par RAM. Après avoir scellé la plaque avec du parafilm, incubez les cellules dans un incubateur désigné par RAM à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires légèrement plus grands que la surface à l’intérieur du capuchon du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et insérez le papier bien ajusté dans le bouchon. Ajoutez 200 microlitres d’acide perchlorique 1 molaire dans chaque tube et 20 microlitres d’hydroxyde de sodium dans le papier filtre installé à l’intérieur du bouchon.

Après l’incubation des cellules, transférez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits dans les tubes préparés et fermez immédiatement les bouchons. Laissez les tubes dans un support à tubes à température ambiante pendant 1 heure.

Parallèlement, pendant l’incubation, installez un flacon à scintillation pour chaque tube et remplissez-le de 4 millilitres de liquide à scintillation. Transférez chaque morceau de papier filtre dans un flacon à scintillation et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie, le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour détecter une contamination potentielle par RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons à scintillation contenant du liquide à scintillation.

Mesurez la radioactivité du carbone 14 dans les flacons à scintillation à l’aide d’un compteur à scintillation et enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail conformément aux directives de radioprotection, si nécessaire.