Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 4:02 min • July 8th, 2025
Les septines sont des protéines cytosquelettiques clés qui se lient aux surfaces incurvées de la membrane plasmique.
Pour observer in vitro l’assemblage de la septine sur des microsphères, il faut d’abord prendre une suspension de billes de silice microscopiques de taille uniforme, agissant comme un support solide pour la formation de bicouches. Vortex cette suspension pour casser les grappes de billes.
Complétez-le avec de petites vésicules unilamellaires, SUV - vésicules sphériques entourées d’une seule bicouche lipidique. Incuber avec une agitation constante, empêchant les microsphères de se déposer.
Pendant l’incubation, les groupes de tête polaire externe facilitent l’adsorption des SUV sur la surface de la microsphère hydrophile. Cette interaction provoque la rupture des SUV, suivie de la fusion des lipides SUV sur la surface incurvée de la microsphère sous la forme d’une couche continue, ce qui entraîne la formation d’une bicouche lipidique sphérique soutenue.
Laver pour éliminer l’excès de lipides non liés et remettre en suspension dans le tampon de réaction. Transférez la suspension sphérique SLB sur une petite région d’une surface recouverte de polyéthylène glycol, afin d’éviter les adsorptions non spécifiques. Ajoutez une suspension de septine marquée par fluorescence dans la chambre et incuber.
Les septines forment des hétéro-oligomères qui reconnaissent la courbure positive des SLB sphériques, polymérisant pour former des filaments. Finalement, les filaments de septine interagissent les uns avec les autres, conduisant à la formation de structures d’ordre supérieur.
Observez les SLB enrobés de septine à l’aide d’un microscope à fluorescence à haute résolution. La présence de fluorescence indique un dépôt sensible à la courbure de la septine.
Tout d’abord, faites tourbillonner la bouteille contenant des microsphères de silice pendant 15 secondes. Ensuite, prenez un bain de sonicate pendant une minute et faites un nouveau vortex pendant 15 secondes pour briser les amas. Mélangez les billes avec du SLBB et 10 microlitres de SUV de 5 millimolaires dans un tube de microcentrifugation à faible adhérence.
Incuber le mélange billes et lipides pendant une heure à température ambiante, sur un agitateur pour éviter la sédimentation. Pendant ce temps, décongelez une lamelle PEGylée et collez-y un tube PCR coupé de 0,2 millilitre. Après l’incubation, centrifugez les billes pendant 30 secondes au RCF désigné.
Après le premier essorage, retirez 50 microlitres de surnageant. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de PRB et mélangez par pipetage vigoureux. Pour les tours suivants, retirez 200 microlitres de PRB, et ajoutez 200 microlitres supplémentaires après le deuxième et le troisième tour, et ajoutez 220 microlitres de PRB après le quatrième tour.
Si vous effectuez un test de compétition avec plusieurs tailles de billes, préparez la réaction en mélangeant des volumes égaux de chaque taille de bille et en diluant 29 microlitres de ce mélange de billes avec 721 microlitres de tampon de réaction. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de billes diluées et 25 microlitres de protéine diluée dans la BSR dans les puits et mélangez.
Si vous mesurez les septines à un état stable, incubez le mélange à température ambiante pendant une heure, puis imagez par microscopie proche du TIRF ou par microscopie confocale.