JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:08 min • July 8th, 2025
L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir des vaisseaux sanguins existants dans des conditions développementales et pathologiques. Une communication étendue entre les cellules endothéliales qui tapissent la surface interne des vaisseaux sanguins et les péricytes environnants - cellules de soutien sur la face externe des vaisseaux sanguins - est cruciale pour l’angiogenèse.
Pour étudier l’angiogenèse in vitro, commencez par des cellules endothéliales et des billes de microsupport enrobées de péricytes en suspension dans une solution de fibrinogène - une glycoprotéine soluble qui agit comme un précurseur de fibrine.
Maintenant, pipetez la suspension de billes dans une plaque de culture contenant une solution de thrombine - une enzyme protéolytique, et incubez. La thrombine se lie à la molécule de fibrinogène, provoquant la formation de monomères de fibrine insolubles dans son clivage, formant ainsi un gel de fibrine polymère. Cette étape assure l’enrobage des billes enrobées de cellules dans le gel de fibrine.
Ensuite, placez une culture de fibroblastes - cellules précurseurs du tissu conjonctif - sur le gel de fibrine et incubez pour permettre l’activation des fibroblastes.
Pendant l’incubation, les fibroblastes sécrètent des facteurs de croissance angiogéniques cruciaux qui déclenchent l’activation des cellules endothéliales. En combinaison, les péricytes adhérents et les cellules endothéliales sécrètent des molécules de signalisation qui aident à la germination des cellules endothéliales dans le gel de fibrine.
Les pousses endothéliales apparaissent sous la forme de protubérances cellulaires allongées enveloppées de péricytes, représentant le stade précoce de l’angiogenèse.
Examinez les boîtes de billes recouvertes de microsupports au microscope à un grossissement de 20 fois pour confirmer que toutes les billes ont été suffisamment recouvertes par les cellules endothéliales.
Transférez les plaques dans une hotte à flux laminaire et utilisez une pipette P1000 pour aspirer vigoureusement et distribuer les solutions de billes enrobées afin de détacher les cellules du fond des plaques et transférer les surnageants dans des tubes individuels.
Laissez les billes se déposer au fond des tubes pendant trois minutes. Ensuite, utilisez la pipette P1000 pour éliminer autant de surnageants que possible sans déranger les grappes de billes. Remettez les billes en suspension dans un millilitre de milieu complet par tube et laissez les billes reposer pendant 30 à 60 secondes. Utilisez la pipette P1000 pour aspirer à nouveau le surnageant et lavez les cellules endothéliales flottantes de la suspension de billes avec un milieu complet frais, deux fois de plus, comme nous venons de le démontrer.
Après le troisième lavage, remettez les billes en suspension dans 2,5 millilitres de solution de fibrinogène. Ajouter 13 microlitres de solution de thrombine par puits, dans une plaque inférieure en verre de 24 puits. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de la solution de billes/fibrinogène dans chaque puits, en prenant soin de pipeter soigneusement les billes directement dans la thrombine, et de pipeter lentement de haut en bas deux à trois fois pour bien mélanger les solutions.
Lorsque tous les puits ont été ensemencés, laissez la solution de thrombine-fibrinogène précoaguler dans la hotte à flux laminaire pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1,5 à 2 heures supplémentaires.
Lorsque le gel s’est complètement solidifié, remettez en suspension les fibroblastes pulmonaires humains normaux à une concentration de 2 x 104 cellules par millilitre dans un milieu complet, et ajoutez un millilitre de fibroblastes dans chaque puits. Ensuite, remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.