Essai de formation d’agrégats de protéines : méthode de détection et de quantification de l’agrégation de protéines dans des cellules cultivées lors de l’induction par un inhibiteur de protéasome

L’élimination des protéines mal repliées dans la cellule est principalement régulée par le système cellulaire ubiquitine-protéasome, dans lequel la protéine est d’abord reconnue et marquée par l’ubiquitine, une petite protéine régulatrice, et trafiquée vers le protéasome, un complexe multiprotéique, pour l’hydrolyse et la clairance.

L’altération de l’activité du système ubiquitine-protéosome, un phénomène courant dans les maladies neurodégénératives, peut provoquer l’accumulation de protéines mal repliées dans les cellules, formant des agrégats de protéines insolubles avec des effets cytotoxiques.

Pour visualiser et quantifier l’agrégation de protéines in vitro, obtenir une suspension de cellules de mammifères transduites - exprimant une protéine mutante marquée par fluorescence qui adopte une conformation mal repliée avec des résidus hydrophobes exposés - dans un milieu approprié.

Pipette augmentant les concentrations d’un inhibiteur de protéasome dans les puits d’une plaque multipuits noire pour minimiser la fluorescence de fond pendant l’imagerie. Semez la suspension de cellules de mammifères dans les puits. Incuber pour permettre aux cellules d’adhérer au fond de la plaque et de proliférer.

Une fois à l’intérieur, l’inhibiteur du protéasome se lie aux sites protéolytiques du protéasome et bloque son activité, provoquant l’accumulation des protéines mutantes exprimées, qui interagissent ensuite via leurs résidus hydrophobes exposés et forment des agrégats cytoplasmiques, conduisant finalement à la mort cellulaire.

Ajoutez un colorant fluorescent de liaison à l’ADN pour colorer les noyaux cellulaires. Imagez la plaque. Les agrégats de protéines mutantes fluorescentes semblent dispersés dans le cytoplasme non coloré.

Les puits contenant des concentrations plus élevées d’inhibiteurs de protéasome présentent un rapport entre le nombre d’agrégats de protéines et le nombre de cellules plus élevé que les puits avec des concentrations plus faibles d’inhibiteurs de protéasome.

Pour le transfert de composé, sur une plaque de polypropylène de stockage à 384 puits, ajouter des dilutions en série de composés par la série de dilution standard 1 à 3. Ensuite, à l’aide d’un manipulateur de liquide équipé d’une tête capillaire de 384 pixels, répartissez 0,25 microlitre d’inhibiteurs de protéasome sur des plaques de dosage noires à fond plat vides de 384 puits. Ensuite, ensemencez 1,5 x 10⁴ cellules sur ces plaques. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Avant d’imager la lignée cellulaire traitée avec des inhibiteurs de protéasome, ajoutez 10 microlitres de DMEM préchauffé avec une solution de coloration et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.

Après la coloration, démarrez le logiciel d’exploitation du microscope automatisé en sélectionnant l’onglet « Microscope ». Tout d’abord, sélectionnez l’onglet « Configuration », puis sélectionnez l’objectif 20X et le bon type de plaque.

Pour permettre une mise au point correcte avec différents types de plaques, assurez-vous que le « collier » est réglé sur la bonne valeur sur l’objectif.

Ensuite, sélectionnez « Exposition 1 », réglez la hauteur de mise au point sur « 0 micromètre », puis sélectionnez « Mise au point ». Une fois qu’il est mis au point, exposez l’appareil photo 1.

Pour optimiser le plan d’exposition, ajustez la hauteur de mise au point et cliquez sur « Prendre la hauteur ». Modifiez les temps d’exposition en puissance laser pour une intensité de pixel maximale d’environ 3 000 pixels et enregistrez les paramètres d’exposition.

Sélectionnez l’onglet « Définition de l’expérience ». Créez une mise en page et une sous-mise en page. Ensuite, faites glisser et déposez la mise en page, l’exposition, l’image de référence, le fichier de recadrage et la sous-mise en page appropriés. Enregistrez ensuite l’expérience.

Enfin, sélectionnez l’onglet « Expérience automatique » et acquérez des images. Pour les images à 2 canaux, sélectionnez d’abord l’algorithme logiciel pour segmenter les objets primaires, tels que les noyaux, le cytosol et les agrégats.