JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:25 min • July 8th, 2025
Chez les bactéries à Gram négatif, les endotoxines lipopolysaccharidiques sont des composants vitaux de la membrane externe bactérienne.
Structurellement, une endotoxine est composée de l’antigène O - la chaîne polysaccharidique la plus externe reliée par un noyau central au lipide A, un glycolipide immunostimulant crucial pour l’activité de l’endotoxine.
Pour étudier l’activité des endotoxines, prenez une éprouvette avec un tampon approprié contenant des anticorps anti-lipides A, du zymosan - un activateur exogène des neutrophiles, et du luminol - un agent chimiluminescent.
Mettre en suspension un volume optimal d’un échantillon de sang infecté composé d’endotoxines et de cellules sanguines, y compris les neutrophiles. Incuber le tube dans des conditions physiologiques.
Au cours de l’incubation, l’anticorps anti-lipide A reconnaît le composant lipide-A de l’endotoxine et se lie à celui-ci via des domaines de liaison à l’antigène, ce qui entraîne la formation d’un complexe anticorps-endotoxine.
Le domaine FC de l’anticorps lié aux endotoxines se lie au récepteur complémentaire des neutrophiles, présentant les endotoxines attachées aux neutrophiles. Cette liaison agit comme un stimulus d’amorçage pour les neutrophiles, déclenchant leur activation.
Les neutrophiles activés engloutissent le zymosan et déclenchent une réponse immunitaire, ce qui entraîne une libération rapide d’espèces réactives de l’oxygène, ROS, à partir des neutrophiles. Ces ROS facilitent l’oxydation du luminol, ce qui entraîne l’émission de lumière par chimiluminescence.
L’intensité du signal de chimiluminescence correspond à l’activité des endotoxines dans l’échantillon de sang.
Tout d’abord, placez les tubes EA à utiliser dans les portoirs de tubes et retirez les bouchons. Utilisez une pipette combinée pour transférer 1 millilitre de réactif EA de la bouteille dans les tubes numéros 1, 2 et 3, en pipetant sur le côté des tubes. Retournez doucement le tube de prélèvement sanguin 20 fois pour mélanger l’échantillon de sang du patient. Ensuite, pipetez 0,5 millilitre de sang du patient dans le tube numéro 4 et le tube numéro 5. Tube vortex numéro 4 pendant 10 secondes.
Placez les supports de tubes avec tous les tubes à essai EA dans l’agitateur de l’incubateur, fermez le couvercle et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, ouvrez le couvercle de l’incubateur et retirez les supports de tubes de l’agitateur.
Tube vortex numéro 5. À l’aide d’une pointe stérile, pipeter 40 microlitres de sang dans les tubes numéro 1 et numéro 2, en double exemplaire.
Tube vortex numéro 4. À l’aide de la même pointe de pipette, transférez 40 microlitres de sang du tube numéro 4 dans le tube numéro 3, en double.
Vortex les six derniers tubes à essai un par un. Remettez les grilles à tubes dans l’agitateur d’incubation et fermez le couvercle. Réglez l’agitateur sur 100 tr/min et démarrez le mouvement pendant 14 minutes.
Insérez la carte à puce étiquetée EA dans le chimiluminomètre et appuyez sur « Démarrer ». Après l’incubation de 14 minutes, suivez les instructions affichées sur le chimiluminomètre. Agitez doucement chaque tube pendant 10 secondes avant de le placer sur le porte-échantillon du chimiluminomètre.
Ouvrez le tiroir à échantillons et placez le tube numéro 1 dans le porte-échantillon. Ensuite, fermez le tiroir à échantillons et attendez la lecture de l’unité de lumière relative. Répétez ce processus de lecture pour les tubes 2 et 3, et tous les doublons, comme indiqué dans le protocole texte.
Une fois que tous les tubes ont été traités, les résultats EA seront calculés et imprimés automatiquement.
Répétez l’ensemble du processus de test pour chaque échantillon de sang à analyser. Conservez le kit de test EA et ses composants dans l’emballage scellé d’origine, à une température comprise entre 2 et 25 degrés Celsius.