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Techniques biologiques
0 vues • 4:38 min • July 8th, 2025
L’endotoxine, une toxine bactérienne à Gram négatif présente sur la membrane externe, est un lipopolysaccharide, LPS, composé principalement de lipides et de polysaccharides, y compris le lipide A et l’antigène O. Lorsqu’il est libéré pendant l’infection, il est reconnu par le système immunitaire, déclenchant des réponses inflammatoires à base de cytokines.
Pour estimer la contamination par des endotoxines dans une nanoformulation de médicament liposomal à l’aide du lysat d’amibocytes de Limulus, LAL, testez, préparez des tubes de réaction, l’un contenant le médicament et l’autre contenant le médicament enrichi d’une concentration connue d’endotoxines.
Ajoutez le réactif LAL contenant du lysat de protéines obtenu à partir de limules, de Limulus polyphemus, de cellules sanguines ou d’amibocytes. Le lysat comprend des protéases à sérine inactives - facteur B, facteur C, enzyme de coagulation - et une protéine de coagulation en gel, le coagulogène.
Vortex les tubes et chargez-les dans un turbidimètre pour mesurer la turbidité des solutions.
En présence de LPS contaminants liés à des médicaments liposomaux, le facteur C sensible au LPS est activé de manière autocatalytique, qui se clive ensuite et active le facteur B qui convertit l’enzyme pro-coagulante en enzyme de coagulation. Cette enzyme activée clive les liaisons peptidiques du coagulogène, formant des monomères de coaguline.
Finalement, les monomères polymérisent via des interactions entre les régions hydrophobes exposées sur la tête d’une personne et la queue hydrophobe d’une autre, conduisant à l’agrégation et à la formation de gel de coaguline trouble insoluble. La turbidité mesurée permet de déterminer la concentration d’endotoxines dans la nanoformulation.
La récupération de pointe calculée à partir des concentrations d’endotoxines dans les échantillons enrichis et les échantillons d’essai dans la plage acceptable n’indique aucune interférence majeure de la nanoformulation, validant la présence d’endotoxines dans le médicament nanoformulé.
Pour la préparation de l’étalon d’étalonnage, utilisez 900 microlitres de lysat d’amébocyte de Limulus ou d’eau de qualité LAL, et 100 microlitres d’endotoxine étalon de contrôle, pour préparer autant de dilutions intermédiaires que nécessaire, afin de permettre la préparation d’un étalon avec une concentration d’une unité d’endotoxine par millilitre.
Ensuite, en utilisant 900 microlitres d’eau de qualité LAL et 100 microlitres de l’étalon d’une unité d’endotoxine par millilitre, préparez un deuxième étalon à une concentration de 0,1 unité d’endotoxine par millilitre.
Ensuite, répétez la dilution en série 10 fois pour préparer deux étalons inférieurs, afin d’obtenir un total de quatre étalons allant de 0,001 à 1 unité d’endotoxine par millilitre.
Pour préparer un contrôle de qualité de 0,05 unité d’endotoxine par millilitre, combinez 50 microlitres d’une unité d’endotoxine par millilitre de solution d’endotoxine standard de contrôle avec 950 microlitres d’eau de qualité LAL.
Ensuite, dans le logiciel, sélectionnez les « Paramètres de l’instrument » et créez le modèle. Sélectionnez « Collecter les données », puis saisissez l’ID de test et le groupe de données dans l’onglet « Général ». Sous l’onglet « Matériel », sélectionnez le type d’instrument et la méthode LAL, puis vérifiez qu’un numéro de série, l’ID du système et les informations du port série s’affichent à l’écran.
Cliquez deux fois sur « OK » pour confirmer la sélection de l’instrument et la communication avec l’instrument, et entrez les ID des échantillons dans le même ordre que celui dans lequel les échantillons seront testés. Ensuite, utilisez les boutons par défaut pour entrer le contrôle négatif, la courbe standard et les échantillons de test.
Ajoutez le volume approprié d’étalons d’étalonnage de contrôle négatif et de contrôle de la qualité dans des tubes en verre pré-étiquetés en double, et ajoutez le volume approprié de LAL au premier flacon de test. Agitez brièvement le flacon et placez-le dans les fentes d’essai appropriées du carrousel d’instruments.
Avant de charger les échantillons, effectuez plusieurs dilutions du nanomatériau d’essai dans la dilution maximale valide démontrée.