Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 2:57 min • July 8th, 2025
La membrane externe des bactéries à Gram négatif contient des endotoxines appelées lipopolysaccharides, ou LPS. Le LPS a une partie oligosaccharide hydrophile et une région lipidique A hydrophobe.
Une fois à l’intérieur de l’hôte, les protéines de liaison au LPS reconnaissent les endotoxines. Ces protéines se lient ensuite aux récepteurs des cellules immunitaires circulatoires. Cette liaison active les cellules immunitaires, qui libèrent des facteurs inflammatoires. La surproduction de ces facteurs exagère la réponse immunitaire, provoquant la mort cellulaire.
Pour détecter les endotoxines à l’aide du lysat d’amibocytes de Limulus, ou test LAL, prenez une formulation contenant des endotoxines liées à la surface lipophile des nanoparticules via leurs parties lipidiques A hydrophobes.
Ajoutez le réactif LAL dans le tube. Ce réactif est un lysat aqueux contenant des enzymes inactives et des protéines dérivées des amébocytes - cellules sanguines du crabe fer à cheval.
Incuber le tube pour faciliter la liaison des endotoxines à la proenzyme du facteur de coagulation C inactif dérivé du lysat, en l’activant de manière autocatalytique.
Le facteur C activé clive une autre proenzyme, le facteur B, formant une protéase qui clive une enzyme de coagulation et la convertit en une forme active - l’enzyme de coagulation du limule. Cette enzyme clive le coagulogène - une protéine de coagulation inactive - en coaguline.
Les monomères de la coaguline se lient via leurs queues hydrophobes aux têtes hydrophobes des autres monomères de la coaguline. Cette autopolymérisation entraîne la formation d’un homopolymère qui se présente sous la forme d’un caillot gélatineux à la base du tube. Retournez doucement le tube.
Un caillot ferme qui reste au fond du tube confirme la présence d’endotoxines.
Pour effectuer une LAL à caillot de gel, préparez l’endotoxine étalon témoin à une concentration finale de 4 lambda, et combinez 100 microlitres d’étalon avec 100 microlitres d’eau, ou d’échantillon d’essai, pour obtenir une concentration finale de l’endotoxine étalon témoin 2 lambda.
Ajouter 100 microlitres de lysat à chaque dilution lambda. Agitez brièvement les tubes et placez le rack de tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 1 heure.
À la fin de l’incubation, retournez les tubes avec un mouvement fluide et enregistrez manuellement les résultats en utilisant plus pour un caillot ferme, et moins pour un caillot nul ou un caillot lâche.