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Techniques biologiques
0 vues • 4:31 min • July 8th, 2025
Les mitocans sont une classe de médicaments qui affectent sélectivement le fonctionnement des mitochondries dans les cellules cancéreuses et induisent l’apoptose.
Pour déterminer la cytotoxicité du mitocan, ensemencez une suspension cellulaire contenant des cellules cancéreuses semi-adhérentes sur une plaque multi-puits. Traitez la plaque avec la solution de mitocan souhaitée et incuber.
Mitocan pénètre dans la cellule cancéreuse pour perturber son activité mitochondriale, entraînant finalement la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses sensibles au mitocan. Traitez les cellules avec une solution de coloration contenant un mélange de colorant Hoechst et d’iodure de propidium.
Hoechst, un colorant fluorescent perméable à la membrane, pénètre dans toutes les cellules et se lie à la région riche en AT de leur ADN, conférant une fluorescence bleue aux noyaux des cellules vivantes et mortes.
En revanche, l’iodure de propidium, un colorant fluorescent imperméable à la membrane, pénètre exclusivement dans les cellules mortes par les parties endommagées de leurs membranes. Le colorant s’intercale entre les bases de l’ADN, conférant une fluorescence rouge supplémentaire aux cellules mortes. La présence des deux colorants dans les noyaux de ces cellules fait apparaître les cellules mortes en violet.
Centrifuger la plaque à basse vitesse pour stabiliser les cellules afin d’améliorer la précision pendant l’imagerie. Imagez au microscope à fluorescence et observez deux populations cellulaires distinctes. Comptez le nombre des deux types de cellules.
Le pourcentage de cellules violettes représentant la population morte par rapport à la population totale indique le potentiel cytotoxique du mitocan d’essai.
Commencez par préparer des solutions des composés d’intérêt à la concentration souhaitée. Assurez-vous toujours de mélanger les composés en tourbillonnant complètement.
Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé, préparez des composés à une concentration finale de 2X. Si vous mesurez la cytotoxicité d’associations de composés, préparez-les à une concentration finale de 4X.
Préparez des contrôles avec solvant seulement en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et aliquote 10 microlitres de la suspension cellulaire pour la coloration au bleu de trypan. Ajoutez 10 microlitres de bleu de trypan à 0,4 % à l’aliquote et utilisez un hémocytomètre ou un compteur de cellules pour compter les cellules viables et non viables.
Injectez les granulés dans le tube de 15 millilitres à 200 x g pendant 5 minutes, puis aspirez ou décantez le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu adapté au test à une densité cellulaire de 3x105 cellules par millilitre. À l’aide d’une pipette multicanaux, ensemencez 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.
Pour les dosages à composé unique, ajoutez 50 microlitres de solution composée 2X dans chaque puits. Pour les puits de contrôle de solvant, ajouter 50 microlitres de milieu d’essai contenant le solvant à une concentration de 2X. Pour les tests combinés, ajoutez 25 microlitres de chacun des composés 4X dans chaque puits. Pour les puits de contrôle composés simples, ajoutez 25 microlitres chacun de solution composée 4X et de milieu d’essai. Assurez-vous que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 0,5 %.
Pour assurer la reproductibilité, ajoutez les médicaments avec la pointe de la pipette touchant le côté des puits, en prenant soin d’ajouter les médicaments à différents endroits. Cette étape doit être effectuée très rapidement, de préférence ne pas prendre plus de 30 minutes par assiette.
Tapotez doucement la plaque pour mélanger le contenu des puits et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
Lorsque vous êtes prêt à colorer les cellules avec Hoechst 33342 et de l’iodure de propidium, préparez une solution de coloration 10X fraîche et ajoutez 10 microlitres dans chaque puits. Tapotez doucement la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Centrifugez la plaque à 200 x g pendant 4 minutes pour amener toutes les cellules au fond de la plaque. Ensuite, essuyez soigneusement le bas de la plaque avec une lingette de laboratoire humide pour enlever tout débris qui pourrait interférer avec l’imagerie. Imagez la plaque dans les 15 minutes suivant la centrifugation.