Dosage de la liaison à l’annexine V : une technique basée sur la fluorescence pour identifier les érythrocytes apoptotiques via le marquage à la phosphatidylsérine

Dans certaines conditions pathologiques, les érythrocytes ou les globules rouges subissent un rétrécissement cellulaire accompagné d’une translocation du phospholipide membranaire - phosphatidylsérine - de l’intérieur au feuillet de la membrane externe, conduisant à la mort cellulaire programmée, l’éryptose, déclenchant la phagocytose cellulaire médiée par les macrophages.

Pour mesurer l’éryptose induite par les ionophores dans une population isolée d’érythrocytes humains via le test de liaison à l’annexine V, commencez par des érythrocytes en suspension dans un tampon sans glucose.

L’épuisement du glucose induit un stress cellulaire, activant la protéine kinase C cytosolique, qui active ensuite les canaux calciques et provoque un afflux d’ions calcium. De plus, les canaux potassiques sont activés, provoquant un efflux de potassium et un rétrécissement cellulaire.

Ensuite, ajoutez de l’ionophore de calcium qui forme un complexe stable avec des ions calcium extracellulaires. Le complexe facilite l’entrée cytosolique des ions calcium à travers la membrane cellulaire, augmentant encore la concentration de calcium intracellulaire. Ceci, à son tour, active le scramblase - un transporteur bidirectionnel de phospholipides - qui aide à la translocation de la phosphatidylsérine de la feuille membranaire cellulaire interne à la foliole de la membrane cellulaire externe, réduisant l’asymétrie membranaire et induisant l’éryptose.

Centrifuger les érythrocytes traités à l’ionophore. Remettre les cellules en suspension dans un tampon de liaison contenant du calcium. Ajouter une solution d’annexine V conjuguée à un colorant fluorescent.

La protéine de liaison aux phospholipides dépendante du calcium, l’annexine V, ayant une affinité élevée pour la phosphatidylsérine, se lie aux résidus de phosphatidylsérine exposés sur le feuillet de la membrane cellulaire externe.

À l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence, séparez la population érythrocytaire en fonction de l’intensité de fluorescence de l’annexine V. Les érythrocytes éryptotiques présentent une intensité de fluorescence de l’annexine V plus élevée que les érythrocytes sains.

Diluez 2 millilitres du tampon de liaison 5X Annexin V dans 8 millilitres de PBS pour obtenir un tampon de liaison 1X. Remettre en suspension les pastilles cellulaires traitées et non traitées à l’ionomycine dans 1 millilitre du tampon de liaison 1X.

Prenez 235 microlitres de suspensions cellulaires dans le tampon de liaison et ajoutez 15 microlitres de conjugué Annexine V-Alexa Fluor 488 dans un tube de microcentrifugation. Incuber les cellules à température ambiante pendant 20 minutes dans un endroit sombre.

Centrifuger à 700 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez le surnageant. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de liaison 1X en suspendant la pastille de cellule dans 1,5 millilitre de tampon de liaison et en centrifugeant à 700 x g pendant 5 minutes à température ambiante.

Retirez le surnageant et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 250 microlitres de tampon de liaison 1X pour les mesures de cytométrie en flux. Maintenant, transférez 200 microlitres d’érythrocytes colorés à l’Annexine V dans des tubes en polystyrène à fond rond de 1 millilitre compatibles avec la cytométrie en flux.

Connectez-vous au logiciel de cytométrie en flux et cliquez sur le bouton « Nouvelle expérience ». Cliquez sur le bouton « Nouveau tube », sélectionnez la « Feuille globale » et choisissez « Appliquer l’analyse » pour mesurer l’intensité de la fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 530 nanomètres.

Définissez le nombre de cellules à 20 000 à collecter pour l’analyse de tri cellulaire activée par fluorescence. Sélectionnez le tube souhaité et cliquez sur le bouton « Charger ». Cliquez sur le bouton « Enregistrer » pour les mesures de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale. Répétez l’opération pour tous les échantillons.

Faites un clic droit sur le bouton 'Échantillon' et cliquez sur 'Appliquer l’analyse par lots' pour générer le fichier de résultat. Faites un clic droit sur le bouton « Spécimen » et cliquez sur « Générer des fichiers FSC ».