Dosage in vitro de l’épuisement du glucose : une méthode basée sur la fluorescence pour quantifier l’absorption cellulaire du glucose par mesure extracellulaire de l’épuisement du glucose

Le glucose, une source d’énergie cellulaire primaire, pénètre dans les cellules via les protéines de transport du glucose de la membrane cellulaire. Le glucose est décomposé dans le cytoplasme cellulaire en pyruvate, via la voie glycolytique, générant de l’énergie par l’adénosine triphosphate, ou ATP, pour le métabolisme cellulaire.

Pour mesurer l’absorption intracellulaire du glucose, commencez par une culture adhérente de fibroblastes dans une plaque multi-puits. Remplacez le milieu par un milieu sans glucose et incuberez. Les cellules métabolisent le glucose disponible pour produire de l’énergie, atteignant un état de manque de glucose.

Remplacez le milieu d’un ensemble de puits par un milieu sans glucose contenant de l’insuline, un stimulateur d’absorption du glucose, et du désoxyglucose fluorescent, un analogue du glucose. Traitez un autre ensemble de puits avec un milieu sans glucose contenant du désoxyglucose fluorescent.

Pendant l’incubation, l’insuline stimule la translocation de transporteurs de glucose supplémentaires vers la membrane plasmique, facilitant ainsi l’augmentation de l’absorption de désoxyglucose fluorescent, en l’absence de glucose.

Le désoxyglucose est phosphorylé et n’est pas métabolisé par les cellules. Parallèlement, la concentration extracellulaire de désoxyglucose fluorescent diminue.

Après l’incubation, prélever le milieu contenant du désoxyglucose fluorescent inutilisé. Traitez les cellules avec un tampon de lyse. Le détergent contenu dans le tampon forme des micelles et solubilise les membranes cellulaires, provoquant la libération de contenu intracellulaire.

À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la fluorescence de l’homogénat cellulaire contenant du désoxyglucose fluorescent intracellulaire et du milieu contenant du désoxyglucose fluorescent extracellulaire inutilisé.

Les fibroblastes stimulés par l’insuline présentent une augmentation de l’absorption intracellulaire de désoxyglucose fluorescent et une diminution correspondante du désoxyglucose fluorescent extracellulaire par rapport aux cellules non stimulées.

Utilisez 8 répétitions pour chaque condition de simulation. Par conséquent, préparez 1 millilitre pour chaque condition de simulation.

Utilisez 7 conditions de simulation sans insuline : FD-glucose de 2,5 microgrammes par millilitre, 1 microgramme par millilitre, 0,5 microgramme par millilitre, 0,2 microgramme par millilitre, 0,1 microgramme par millilitre, 0,05 microgramme par millilitre et 0 milligramme par millilitre dans une plaque de 96 puits.

Utilisez 7 conditions de stimulation avec de l’insuline : FD-glucose de 2,5 microgrammes par millilitre, 1 microgramme par millilitre, 0,5 microgramme par millilitre, 0,2 microgramme par millilitre, 0,1 microgramme par millilitre, 0,05 microgramme par millilitre et 0 microgramme par millilitre dans une autre plaque de 96 puits.

Pour préparer les conditions de stimulation, diluez 1 microlitre de 5 milligrammes par millilitre de solution de travail FD-glucose et 999 microlitres de DMEM sans glucose pour obtenir 1 millilitre de solution mère.

À l’aide de cette solution mère, préparez des dilutions 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 et 1:100 000 de FD-glucose pour obtenir 2,5 microgrammes par millilitre, 1 microgramme par millilitre, 0,5 microgramme par millilitre, 0,2 microgramme par millilitre, 0,1 microgramme par millilitre, 0,05 microgramme par millilitre dans des tubes de 2 millilitres immédiatement avant les expériences dans une enceinte de biosécurité sans lumières. Ajoutez 1 microlitre d’insuline à chacune de ces conditions.

Après 40 minutes d’incubation, décantez le DMEM sans glucose de chaque puits dans des plaques de 96 puits et absorbez le liquide restant avec des serviettes en papier stériles. Ajouter 100 microlitres chacun des diverses conditions de traitement décrites ci-dessus, aux puits le long d’une colonne, et 100 microlitres de la même condition de traitement aux puits le long de la rangée dans les deux plaques de 96 puits. Étiquetez les plaques qui ont utilisé les conditions avec et sans insuline.

Ajoutez du DMEM sans glucose seul dans les puits de contrôle. Incuber la plaque pendant 40 minutes dans un incubateur de culture cellulaire dans l’obscurité.

Après que les cellules ont été stimulées pendant 40 minutes, transférez les milieux de stimulation des deux plaques dans de nouvelles plaques à 96 puits, en conservant la même disposition expérimentale. Lavez les cellules avec du PBS. Retirez le PBS et décantez toute solution restante sur des serviettes en papier stériles.

Ajouter un inhibiteur de protéase au tampon de dosage de la radio-immunoprécipitation pour protéger les protéines. Placez les plaques contenant le dosage de la radio-immunoprécipitation dans un agitateur pendant 30 minutes.

À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nanomètres respectivement, d’abord dans le milieu contenant du FD-glucose extracellulaire, puis dans la plaque contenant des cellules lysées par dosage de radio-immunoprécipitation à la fin d’une incubation de 30 minutes.