Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:04 min • July 8th, 2025
Dans les tissus, le glucose extracellulaire pénètre dans les cellules via une diffusion facilitée par des transporteurs de glucose spécifiques.
Le glucose est décomposé en pyruvate dans le cytoplasme cellulaire via la glycolyse, une voie métabolique, générant de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate, ou ATP, pour les processus métaboliques cellulaires.
Pour mesurer l’absorption de glucose ex vivo, commencez par du tissu hépatique de souris de petite taille fraîchement récolté. Ajouter un tampon approprié pour maintenir les conditions physiologiques.
Ensuite, transférez le tissu dans une plaque multi-puits contenant un milieu sans glucose. Suivez-le par incubation dans un milieu sans glucose complété par du désoxyglucose, un analogue du glucose marqué par fluorescence. La petite taille du tissu permet l’entrée du désoxyglucose.
Le désoxyglucose pénètre dans les cellules par l’intermédiaire des transporteurs de glucose, en l’absence de glucose. À l’intérieur des cellules, le désoxyglucose subit une phosphorylation mais n’est pas métabolisé davantage, ce qui entraîne son accumulation.
Prélever le milieu contenant du désoxyglucose inutilisé marqué par fluorescence aux points temporels souhaités. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la fluorescence du désoxyglucose extracellulaire, qui peut être corrélée avec l’absorption tissulaire intracellulaire du désoxyglucose.
Incuber les tissus ou les organes prélevés dans une plaque à 6 puits contenant du PBS pendant une minute. Manipulez chaque tissu ou organe dans un puits séparé. Après une minute, placez chaque mouchoir sur une serviette en papier stérile pour absorber le PBS.
Transférez les tissus ou les organes dans une plaque séparée à 6 puits contenant 4 000 microlitres de DMEM sans glucose, et incubez pendant deux minutes. Après deux minutes, retirez et transférez les tissus dans les puits d’une plaque à 6 puits contenant 0,29 millimolaire de solution de travail FD-glucose. Incuber les plaques à 6 puits contenant des tissus dans une solution de travail FD-glucose à 37 degrés Celsius.
Prélever 100 microlitres de solution de travail FD-glucose dans chaque puits après 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 minutes d’incubation, et transférer 100 microlitres de solution de travail FD-glucose collectés dans des plaques de 96 puits pour analyser la cinétique de la déplétion extracellulaire du FD-glucose. Agiter avant et après le prélèvement.
Mesurez la fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nanomètres respectivement à l’aide d’un lecteur de microplaques.