JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:39 min • July 8th, 2025
La myosine - une protéine motrice - a un domaine de tête globulaire qui interagit avec l’actine - une protéine filamenteuse. Cette interaction est essentielle pour la translocation de la myosine le long des filaments d’actine. Pour étudier cette liaison in vitro, effectuez un test de motilité inversée de la myosine sur de l’actine attachée en surface.
Pour commencer, assemblez une chambre de dosage en plaçant une lamelle recouverte de polyéthylène glycol biotinylé - PEG sur une lame de microscope de sorte que la surface revêtue soit tournée vers l’intérieur, créant ainsi le haut de la chambre.
Faites passer une solution contenant de l’avidine - une glycoprotéine - à travers la chambre. L’avidine se lie à la biotine avec une grande affinité, ce qui améliore l’adhésion de l’actine. Ensuite, faites couler des filaments d’actine marqués à la biotine avec un fluorophore rouge. Le ligand de biotine se lie à l’avidine, immobilisant les filaments à la surface de la lamelle.
Enfin, ajoutez des protéines de myosine 5A marquées par des protéines fluorescentes vertes dans un tampon contenant des molécules d’adénosine triphosphate, ou ATP. La myosine 5A à deux têtes, contenant une tête arrière et une tête principale, interagit avec les filaments d’actine immobilisés. La tête traînante de la myosine se lie à un ATP et se détache de l’actine.
L’hydrolyse de l’ATP génère une course de puissance, permettant à la tête arrière de se lier à une position en avant de la tête principale le long du filament. Par des coups de force successifs, la myosine se déplace le long du filament d’actine immobilisé sans se détacher.
À l’aide de la microscopie à fluorescence, enregistrez le mouvement des molécules de myosine vertes sur les filaments d’actine rouges.
Préparez les solutions pour le dosage de la motilité inversée de la myosine 5a et conservez-les sur de la glace.
Lavez la chambre avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT. Débit en 10 microlitres de 1 milligramme par millilitre BSA en tampon de motilité avec DTT. Répétez cette opération deux fois, en attendant une minute après le troisième lavage. Utilisez du papier de soie ou du papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement.
Ensuite, lavez trois fois la chambre avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT. Versez 10 microlitres de la solution de NeutrAvidin dans un tampon de motilité avec DTT et attendez une minute. Ensuite, lavez trois fois avec 10 microlitres de cette solution.
Versez 10 microlitres de tampon de motilité contenant de l’actine bRh avec DTT à l’aide d’une pointe de pipette à gros alésage et attendez une minute. Ensuite, lavez trois fois avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT.
Versez 30 microlitres de tampon final avec 10 nanomolaires de myosine 5a et chargez-les immédiatement sur le microscope à fluorescence à réflexion interne totale. Commencer l’enregistrement une fois que la mise au point optimale pour l’imagerie TIRF est trouvée.