JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:29 min • July 8th, 2025
Les cellules intestinales produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Des niveaux modérés de ROS maintiennent l’homéostasie cellulaire, tandis que des niveaux élevés de ROS peuvent provoquer la mort cellulaire.
Pour quantifier les niveaux de ROS in vitro, commencez par une culture d’organoïdes intestinaux 3D de souris. Ces organoïdes présentent une architecture intestin-épithélium avec des protubérances en forme de crypte abritant des cellules souches vertes exprimant la fluorescence. Ils contiennent également des cellules différenciées en forme de villosités à la périphérie, entourant la lumière centrale comprenant des cellules mortes et des débris. Toutes ces cellules produisent différents niveaux de ROS.
Maintenant, traitez les organoïdes dans les puits désignés avec des modulateurs ROS. De par leur nature, les modulateurs peuvent agir comme des inducteurs ou des inhibiteurs de ROS. Après l’incubation pendant la durée requise, retirez le milieu épuisé.
Ajoutez une enzyme protéolytique à la culture, perturbant l’architecture 3D des organoïdes et libérant différentes cellules en suspension. Ensuite, ajoutez une sonde fluorogénique sensible aux ROS et incubez.
En entrant dans les cellules, les sondes réagissent avec les ROS et s’oxydent pour produire une fluorescence rouge. Traitez les cellules avec du DAPI - un colorant fluorescent liant l’ADN - qui colore sélectivement les noyaux des cellules mortes - créant un contraste avec les cellules vivantes.
À l’aide d’un cytomètre en flux, analysez les cellules vivantes DAPI-négatives pour obtenir un signal de fluorescence rouge correspondant à leur taux de ROS. Selon la nature des modulateurs, les inducteurs augmentent les niveaux de ROS tandis que les inhibiteurs les diminuent.
Ajouter 1 microlitre de la solution mère de N-acétylcystéine dans les puits de contrôle négatifs de la plaque à fond rond à 96 puits contenant les organoïdes.
Après une incubation de 1 heure, ajoutez 1 microlitre de solution mère d’hydroperoxyde de tert et de butyle dans les puits correspondants et incubez pendant 30 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, retirez le milieu sans déranger le BMM attaché et transférez-le sur une autre plaque à fond rond de 96 puits. Gardez cette assiette de côté.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de trypsine et, à l’aide d’une pipette multicanaux, pipetez de haut en bas cinq fois pour détruire le BMM. Après une courte incubation de 5 minutes, dissociez les organoïdes en pipetant une seconde fois de haut en bas.
Faites tourner la plaque et jetez le surnageant en inversant la plaque. Ajoutez le milieu précédemment collecté dans une autre plaque à 96 puits, dans les puits correspondants, et remettez les cellules en suspension en pipetant cinq fois de haut en bas.
Ensuite, ajoutez 1 microlitre de sonde fluorogène et incubez pendant 30 minutes. Ensuite, tournez à nouveau la plaque et remettez les cellules en suspension avec 250 microlitres de solution DAPI. Transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie en flux et maintenez les tubes sur de la glace.
Optimisez les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur les tensions de contrôle et laser non colorées, pour chaque fluorophore à l’aide d’échantillons monocolorés. Ensuite, à l’aide d’une stratégie de contrôle appropriée, collectez un minimum de 20 000 événements.