Dosage de SUMOylation : une technique in vitro pour détecter l’état de SUMOylation des protéines de substrat par immunobuvardage

La SUMOylation se produit en raison de la fixation de petits modificateurs de type ubiquitine, les SUMO, aux protéines du substrat.

La SUMOylation se produit lorsqu’un peptide SUMO mature est activé par une enzyme - E1. Lors de l’activation, le SUMO est transféré au site actif de l’enzyme conjugaison - E2 - attachant le SUMO au résidu de lysine de la protéine de substrat. Une autre ligase - E3 - améliore l’efficacité de cette interaction.

Pour effectuer un test de SUMOylation in vitro, commencez avec un tube contenant un mélange de la protéine du substrat - p53, d’enzymes et de peptides SUMO, et incubez pour induire la SUMOylation. Complétez le tube avec du dodécylsulfate de sodium - tampon contenant du SDS, mettant fin à la réaction. Chauffez l’échantillon pour dénaturer les protéines.

Chargez le mélange de protéines dans le puits d’un gel SDS-PAGE et effectuez une électrophorèse. Les protéines SUMOylées de poids moléculaire plus élevé se déplacent plus lentement que leurs variantes non SUMOylées, générant deux bandes distinctes.

Transférez le gel sur une membrane buvard présente sur un papier filtre humide dans un appareil à électrobuvard. Couvrir d’un papier filtre humide et transférer électro-transférez les protéines du gel sur la membrane.

Traitez la membrane avec des anticorps anti-p53, qui se lient à p53. Superposition avec des anticorps secondaires conjugués à des enzymes qui se lient aux complexes anticorps-p53. Ajoutez un substrat chimiluminescent pour générer un produit luminescent et imager la membrane.

Une bande de poids moléculaire plus élevé correspond aux protéines SUMOylées, tandis que la bande inférieure correspond aux variantes de protéines non SUMOylées.

Ajouter 3 microlitres de 100 nanogrammes par microlitre de tag-K-bZIP purifié dans la réaction de mélange maître de SUMOylation in vitro. Ensuite, mélangez doucement le contenu du mélange principal et incubez à 30 degrés Celsius pendant 3 heures.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de 2x SDS-PAGE avec tampon de chargement pour arrêter la réaction. Ensuite, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 5 minutes pour dénaturer la protéine.

Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 % et faites fonctionner le gel à 80 volts pendant environ 120 minutes jusqu’à ce que le colorant atteigne le fond du gel.

Une fois l’électrophorèse terminée, débranchez l’appareil à gel et transférez le gel dans un tampon de transfert semi-sec pendant 5 minutes. Ensuite, faites tremper la membrane PVDF dans un autre récipient rempli de méthanol pendant 1 minute.

Retirez la membrane PVDF du méthanol et trempez-la dans un tampon de transfert semi-sec. Ensuite, agitez doucement la membrane pendant 5 minutes.

Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil électrophorétique semi-sec. Pré-mouillez un papier filtre et préparez un sandwich de gel au bas de l’anode en platine. Après avoir fixé la plaque cathodique dans le couvercle de sécurité, faites fonctionner le transfert à courant constant de 15 volts pendant 90 minutes. Ensuite, coupez l’alimentation électrique et retirez la membrane PVDF, après avoir débranché l’appareil semi-sec.

Maintenant, bloquez la membrane PVDF avec un tampon de blocage, pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital à 30 tours par minute. Ensuite, hybridez la membrane PVDF avec un anticorps anti-p53 et un tampon de blocage pendant 12 à 16 heures à 4 degrés Celsius, sur un mélangeur en suspension à 30 tours par minute.

Ensuite, retirez la membrane PVDF et transférez-la dans un récipient rempli de solution saline tamponnée TRIS avec Tween-20. Ensuite, trempez la membrane PVDF dans une solution saline tamponnée TRIS avec du Tween-20 pendant 30 minutes sur l’agitateur orbital à 45 tours par minute. Ensuite, hybridez la membrane PVDF avec un anticorps anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort diluée dans un tampon bloquant, pendant 1 heure à température ambiante sur le mélangeur en suspension à 30 tours par minute.

Ensuite, lavez trois fois la membrane PVDF avec une solution saline tamponnée TRIS avec Tween-20. Après le lavage, faites tremper la membrane PVDF dans du sérum physiologique tamponné TRIS Tween-20 pendant 30 minutes sur le mélangeur à suspension à 45 tours par minute. Ensuite, remplacez la solution saline tamponnée TRIS Tween-20 par une solution saline tamponnée au phosphate pour préserver la membrane PVDF à 4 degrés Celsius jusqu’à 12 heures.

Ensuite, mélangez les réactifs de substrat chimiluminescents améliorés 1 et 2 dans un rapport de 1:1. Ensuite, retirez la membrane PVDF de la solution saline tamponnée au phosphate et épongez brièvement avec des poches de perforation pour absorber l’excès d’humidité.

Ajoutez immédiatement 400 microlitres de réactif chimiluminescent à la surface de la membrane et attendez 3 à 5 minutes. Épongez brièvement pour drainer l’excès de réactif chimiluminescent, empêchant la membrane de sécher complètement. Utilisez un système d’imagerie par luminescence pour exposer la tache.