JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 2:59 min • July 8th, 2025
Les protéines nucléaires mal repliées sans structure tertiaire définie sont marquées avec de petits modificateurs de type ubiquitine, SUMO, et des molécules d’ubiquitine, qui facilitent leur dégradation par le système protéolytique, y compris le système ubiquitine-protéasome, l’UPS.
Dans plusieurs maladies neurodégénératives, le dysfonctionnement de l’UPS provoque l’accumulation et l’agrégation de protéines nucléaires mal repliées, entraînant la mort neuronale.
Pour étudier le taux de dégradation des protéines nucléaires mal repliées in vitro, traiter une culture de cellules de mammifères adhérentes avec un mélange comprenant une protéine mal repliée marquée par fluorescence codant pour de l’ADN plasmidique et un réactif de transfection.
Les cellules transfectées avec succès expriment des protéines à demi-vie courte mal repliées marquées par fluorescence et marquées avec un signal de localisation nucléaire. Lors du transport vers le noyau, ces protéines mal repliées subissent une SUMOylation et une ubiquitination et sont transférées à l’UPS pour la dégradation et l’élimination des protéines.
Après l’incubation, remplacer le milieu par un milieu à faible fluorescence contenant du cycloheximide. Le cycloheximide, une molécule perméable aux cellules, se lie à la grande unité ribosomique et bloque la phase d’élongation de la traduction des protéines et la synthèse ultérieure des protéines, facilitant ainsi l’étude du taux de dégradation des protéines mal repliées traduites par fluorescence.
Traitez un ensemble de puits avec un inhibiteur de protéasome pour bloquer l’activité du protéasome et provoquer l’accumulation des protéines mal repliées. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la fluorescence des protéines mal repliées.
Une baisse de la fluorescence en fonction du temps indique une dégradation des protéines mal repliée. Les cellules traitées avec l’inhibiteur du protéasome présentent une intensité de fluorescence similaire au fil du temps, dénotant l’inhibition de la dégradation des protéines mal repliées.
Après l’ensemencement et la transfection des cellules HeLa dans des plaques de 96 puits conformément au protocole de texte, 20 à 24 heures après la transfection, examinez les cellules pour détecter l’expression de la GFP. Retirez le milieu à environ 200 microlitres de 1x PBS dans chaque puits, puis aspirez-le pour éliminer le DMEM résiduel.
Ajoutez 60 microlitres de DMEM à faible fluorescence avec 5 % de FBS et 50 microgrammes par millilitre de cycloheximide, et ajoutez 10 micromolaires de MG132 à un ensemble d’échantillons.
Avec un lecteur de plaques à fluorescence, mesurez le signal GFP en lisant les plaques toutes les heures pendant une période maximale de 8 à 10 heures. Exportez les données et effectuez une analyse statistique selon le protocole texte.