Le test de la luciférase : un test à haut débit pour mesurer les signaux luminescents à l’aide de biorapporteurs basés sur le système de nanoluciférase

La luciférase est une enzyme qui oxyde son substrat pour former un produit bioluminescent.

Cette propriété de la luciférase est utile pour la conception d’un système rapporteur basé sur la nanoluciférase dans lequel la version divisée de l’enzyme est utilisée. Dans ce système, les fragments les plus petits et les plus grands possèdent une grande affinité de liaison les uns envers les autres et peuvent reconstituer l’enzyme fonctionnelle.

Pour utiliser le système basé sur la nanoluciférase pour détecter la protéine cible - domaine de liaison au récepteur de la glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 - commencez par une boîte de culture contenant des cellules adhérentes. Ces cellules contiennent un plasmide codant pour la protéine cible en conjonction avec une séquence spécifique pour le plus petit fragment de nanoluciférase modifiée.

Lors de l’expression, les cellules cultivées produisent des biorapporteurs - des protéines cibles recombinantes fusionnées avec le plus petit fragment de la luciférase. Traitez les cellules avec un tampon de lyse et incubez sous agitation. Les composants tampons lysent rapidement les cellules, libérant le contenu cellulaire, y compris les biorapporteurs, dans le surnageant.

Transférez le surnageant sur une plaque d’essai multipuits. Complétez chaque puits avec la solution contenant les gros fragments de nanoluciférase fractionnée et incubez.

Au cours de l’incubation, le grand fragment se lie spontanément à la petite sous-unité du biorapporteur et atteint une conformation fonctionnelle. Ajoutez une solution contenant de la furimazine - le substrat, et placez la plaque de dosage dans un luminomètre.

L’enzyme fonctionnelle oxyde la furimazine, émettant un signal luminescent brillant. L’amplitude du signal est en corrélation avec la concentration de protéines cibles.

Pour évaluer le signal luminescent du biorapporteur à l’aide d’un test de luciférase, préparez d’abord les composants de la réaction et utilisez le surnageant comme source du biorapporteur.

Diluez le LgBiT et le substrat à 1x avant utilisation. Transférez 50 microlitres de surnageant de chaque puits ou tube, dans une plaque de 96 puits, et ajoutez 50 microlitres de 1x LgBiT dans chaque puits. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.

Ouvrez le logiciel du luminomètre. Ajoutez 50 microlitres de substrat 1x dans chaque puits. Placez la plaque dans le luminomètre et lancez le logiciel.