Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:11 min • July 8th, 2025
Lors d’une infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère, ou SRAS-CoV-2, le domaine de liaison au récepteur de la protéine de pointe du virus, RBD, se lie à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 de la cellule hôte, ACE2, facilitant ainsi l’entrée dans les cellules virales. En réponse, le système immunitaire produit des anticorps qui se lient au RBD viral et empêchent l’entrée cellulaire, réduisant ainsi l’infectiosité virale.
Pour détecter les anticorps du SARS-CoV-2 ciblant le RBD, prenez une suspension de biorapporteur recombinant comprenant des fragments de protéines de petite taille, fusionnés à un RBD de spicule du SARS-CoV-2. Ajoutez des anticorps standard contre le SRAS-CoV-2 ciblant le RBD et des billes magnétiques de liaison aux anticorps.
Pendant l’incubation, la région de l’anticorps Fc se lie aux domaines de liaison Fc des billes. De plus, le biorapporteur recombinant se lie aux anticorps du SRAS-CoV-2 ciblant le RBD liés aux billes.
Après l’incubation, centrifuger le mélange. Retirer le surnageant non lié contenant le biorapporteur. Remettez les billes liées en suspension dans le tampon. Transférer dans une plaque multipuits.
Ajoutez une solution contenant des fragments de protéines de grande taille, ayant une grande affinité pour les fragments de protéines de petite taille. Des fragments de protéines de grande et de petite taille se lient ensemble, formant une enzyme luciférase active modifiée.
Ajouter la furimazine, un substrat de luciférase. La luciférase catalyse l’oxydation de la furimazine, provoquant l’émission de lumière. À l’aide d’un luminomètre, mesurez la luminescence, indicatrice de la présence d’anticorps neutralisants.
Des intensités de signal élevées suggèrent des concentrations élevées d’anticorps anti-SARS-CoV-2 ciblant le RBD.
Afin d’effectuer le test de détection des anticorps HiBiT-RBD, préparez le biorapporteur HiBiT-RBD et combinez 50 microlitres du surnageant contenant HiBiT-RBD avec 1 microgramme de l’anticorps commercial SARS-CoV-2-RBD dans un microtube de 1,5 millilitre.
Ajoutez 20 microlitres de protéine de liaison aux immunoglobulines, ou protéine G, à la solution. Portez le volume total à 300 microlitres en ajoutant du PBS. Incuber les tubes sur un agitateur ou un rotateur pendant 30 minutes, centrifuger à 12 000 x g pendant 30 secondes, puis jeter le surnageant et laver avec du PBS. Répétez le processus trois fois pour retirer le HiBiT-RBD libre.
Remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres de PBS et transférez-les sur une plaque à 96 puits. Ajoutez 50 microlitres de 1x LgBiT et attendez 5 minutes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de substrat 1x NanoLuc. Lisez immédiatement le signal de luminescence à l’aide d’un luminomètre.