Dosage cellulaire des anticorps neutralisants AAV : une technique colorimétrique pour détecter les anticorps neutralisants contre des virus adéno-associés spécifiques dans le sérum

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Techniques biologiques

0 vues • 4:54 min • July 8th, 2025

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Les virus adéno-associés recombinants, les rAAV, les virus à ADN monocaténaire génétiquement modifiés, non enveloppés, sont des porteurs de gènes thérapeutiques prometteurs.

Les rAAV se fixent aux récepteurs membranaires cellulaires cibles et subissent une endocytose médiée par la clathrine, facilitant la livraison nucléaire du génome du rAAV et l’expression génique thérapeutique. Cependant, les anticorps neutralisants du système immunitaire dirigés contre les rAAV se lient à l’épitope spécifique du rAAV, interférant avec la liaison à la membrane cellulaire, l’entrée cellulaire et le transfert de gènes.

Pour détecter les anticorps neutralisants contre des rAAV spécifiques dans le sérum de mouton, il faut d’abord obtenir des concentrations appropriées de sérum dilué. Ajouter des AAV recombinants exprimant le gène de la phosphatase alcaline placentaire humaine, hPLAP. Permettre aux anticorps neutralisants de se lier et de neutraliser les AAV.

Transférez ce mélange dans les puits d’une plaque multi-puits contenant une culture de cellules épithéliales humaines adhérentes. Lors de l’incubation, les AAV subissent une endocytose cellulaire. Les cellules transduites expriment le hPLAP, lié à la membrane cellulaire. Cependant, les AAV neutralisés ne peuvent pas pénétrer dans les cellules.

Jetez le milieu des puits. Utilisez du paraformaldéhyde pour fixer les cellules. Ajouter un tampon préchauffé et chauffer les cellules pour inactiver la phosphatase alcaline cellulaire endogène ; hPLAP est résistant à l’inactivation thermique.

Ajoutez les substrats hPLAP - phosphate de bromochloroindolyle, BCIP, et tétrazolium bleu nitreux, NBT. hPLAP déphosphoryle BCIP, qui subit une dimérisation, formant un intermédiaire bleu. Les ions hydrogène libérés réduisent le NBT, produisant un précipité violet insoluble. Image pour observer les dépôts violets entourant les cellules transduites.

Une proportion plus faible de zone violette suggère une concentration accrue d’anticorps neutralisants AAV.

Commencez à plaquer les cellules HT1080 le premier jour en diluant les cellules à une concentration de 1 x 105 cellules/mL dans un milieu DMEM complet préchauffé.

Ensuite, ensemencez 100 microlitres de cellules, par puits, dans des plaques claires à fond plat de 96 puits à la concentration de 1 x 104 cellules par puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une nuit pendant 16 à 22 heures.

Le deuxième jour, générer des dilutions en série des échantillons de sérum d’intérêt dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à l’aide de DMEM complet préchauffé.

Dans chaque tube contenant des échantillons de sérum dilué, ajoutez 66 microlitres de la solution de travail du virus du génome viral 7,5 x 106 par microlitre. Mélangez les dilutions virus/sérum par pipetage, puis placez les tubes contenant les mélanges virus/sérum dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes, pour permettre une neutralisation potentielle.

Après 30 minutes, pipetez 100 microlitres du mélange virus/sérum dans chaque puits sur la plaque de 96 puits contenant 1 x 104 cellules par puits, puis enveloppez la plaque dans une feuille pour la placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une nuit pendant 16 à 24 heures.

Le troisième jour, aspirez le média des puits de la plaque de 96 puits à l’aide d’une hotte sous vide sans perturber les cellules collées, et ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Après avoir enveloppé la plaque dans du papier d’aluminium, laissez-la pendant 10 minutes à température ambiante.

Plus tard, lavez et aspirez les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS à température ambiante. Après le deuxième lavage, pipetez 200 microlitres de PBS préchauffé dans chaque puits et enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium suivi d’une incubation à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes pour dénaturer l’activité de la phosphatase alcaline endogène.

Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de BCIP/NBT fraîchement préparé et dissous dans chaque puits et incubez les plaques emballées à température ambiante pendant 2 à 24 heures. Plus tard, prenez des photos de chaque puits à l’aide d’un objectif 4x dans une caméra de microscope optique, en assurant l’utilisation cohérente de la même exposition, de l’équilibre des blancs et des paramètres de lumière pour tous les tests.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026