Dosage de la paralysie basé sur le rapporteur fluorescent : une technique pour évaluer la formation progressive associée à l’âge du rapporteur fluorescent de polyglutamine et la paralysie associée chez Caenorhabditis elegans

L’homéostasie des protéines cellulaires, ou protéostasie, implique la régulation du repliement et de la fonction des protéines, ainsi que la dégradation des protéines mal repliées. Au cours du vieillissement, la machinerie de la protéostasie décline, ce qui entraîne l’accumulation et l’agrégation de protéines mal repliées, ce qui entraîne un dysfonctionnement cellulaire.

Pour déterminer le déclin de la protéostasie associé à l’âge, commencez par Caenorhabditis elegans transgénique adulte synchronisé sur le plan du développement.

Les cellules musculaires de ces vers expriment des protéines avec des répétitions de polyglutamine anormalement expansée, ou polyQ, fusionnées avec une étiquette fluorescente. Les protéines PolyQ ont tendance à mal se replier et, par conséquent, lors de l’accumulation, peuvent former des agrégats.

Transférez les vers sur une lame de microscope comprenant un tampon d’agarose et immobilisez avec un produit chimique approprié pour l’imagerie des cellules vivantes. À l’aide d’un microscope à fluorescence, visualisez les muscles de la paroi corporelle des vers sur une période de temps pour déterminer les signaux de foyers brillants et fluorescents, correspondant aux agrégats polyQ fluorescents.

En quelques jours, en raison du déclin de la protéostasie liée à l’âge, une accumulation progressive d’agrégats polyQ se produit, entraînant un nombre plus élevé de foyers fluorescents. L’augmentation des agrégats polyQ dans les cellules musculaires provoque une toxicité et perturbe la fonction des cellules musculaires, entraînant une paralysie.

Au microscope, notez le nombre de vers vivants, paralysés, sans mouvement lors de stimuli mécaniques. L’augmentation du taux de paralysie des vers suggère un déclin de la protéostasie des tissus musculaires chez les vers associé à l’âge.

Pour mesurer le déclin de la protéostasie dans le tissu musculaire, choisissez 20 animaux et montez-les sur une lame de microscope avec un tampon d’agarose à 3 % et une goutte de 5 microlitres d’azoture de sodium de 10 millimolaires.

Une fois que tous les vers sont immobilisés, imagez l’ensemble du corps des animaux à l’aide d’un objectif à grossissement 10x. Utilisez un filtre FITC ou YFP, et la même exposition, pour chaque animal. Lorsque vous avez terminé, jetez les diapositives.

Comptez le nombre de foyers dans les muscles de la paroi corporelle de l’animal entier. Les foyers sont des signaux plus brillants et ponctués qui peuvent être différenciés du signal soluble plus faible en arrière-plan.

Les jours de pointage, regardez les plaques avec les animaux et notez le nombre d’animaux paralysés. Ensuite, retirez les animaux paralysés de l’assiette.

À la fin de l’expérience, calculez le taux de paralysie pour chaque condition et tracez la progression de la paralysie.