Amplified luminescent Proximity Homogeneous Assay : Un test de proximité basé sur des billes pour cribler de petites molécules inhibant les interactions protéine-protéine

Dans les systèmes biologiques, la proximité d’une protéine avec son partenaire spécifique est un déterminant crucial de la réussite de l’interaction protéine-protéine. Avec de petites molécules inhibitrices présentes, ces protéines ne peuvent pas se rapprocher les unes des autres, perturbant leurs interactions.

Pour cribler des molécules inhibitrices capables de perturber les interactions entre deux protéines - un chaperon et un co-chaperon - prenez une plaque multi-puits contenant diverses petites molécules. Complétez les puits avec des perles de donneur ayant des co-chaperons attachés à leur surface. Ces billes contiennent des photosensibilisants pour le dosage de la chimiluminescence.

Ajoutez une boue de billes accepteuses conjuguées aux séquences peptidiques dérivées du chaperon qui se lient spécifiquement au co-chaperon. Les billes contiennent un colorant à base de thioxène et des fluorophores essentiels à la visualisation.

Dans les puits avec des molécules non inhibitrices, de fortes affinités entre les peptides de liaison au chaperons et les co-chaperons attirent les billes accepteurs et donneuses. Alors que les billes restent distantes lorsque des inhibiteurs sont présents.

À l’aide d’un lecteur de chimiluminescence, étudiez l’interaction. Lors de l’illumination à une longueur d’onde spécifique, les photosensibilisateurs à billes donneuses émettent des oxygènes singulet hautement réactifs.

En l’absence de molécules inhibitrices, les espèces émises atteignent les billes d’accepteur situées à proximité des proximaux et réagissent avec les molécules de colorant, provoquant une chimiluminescence. Cette énergie active les fluorophores des billes d’accepteur, provoquant l’émission de lumière.

En revanche, dans les puits avec des molécules inhibitrices, les oxygènes singulets subissent une décomposition, conduisant à une absence d’émission de lumière, indiquant une inhibition réussie des interactions protéine-protéine.

Ajouter des billes de donneur de glutathion à une concentration de 10 microgrammes par millilitre dans du PBS. Ajoutez GST-FKBP51 à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et incubez la réaction pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius dans l’obscurité.

Effectuer des dilutions en série du composé d’essai dans du DMSO. Ajouter 0,25 microlitre de dilutions du composé d’essai en trois exemplaires, dans le coin de chaque puits d’une plaque de 384 puits.

Pour le contrôle négatif, ajoutez 0,25 microlitre de DMSO, et pour le contrôle positif, ajoutez 0,25 microlitre de peptide C-terminal Hsp90 dans les puits.

Ajoutez 22,5 microlitres de la solution contenant des billes donneuses de glutathion avec des protéines marquées GST dans chaque puits. Secouez soigneusement l’assiette avec les mains et incubez dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Diluez les billes de l’accepteur avec le peptide C-terminal Hsp90 attaché à une concentration de 100 microgrammes par millilitre dans 0,5x PBS. Ajouter 2,25 microlitres de billes d’accepteur diluées dans chaque puits. Secouez et incubez l’assiette dans l’obscurité pendant 15 minutes comme indiqué.

Allumez l’instrument de lecture de plaques, mesurez le signal de la plaque et analysez les données comme décrit dans le manuscrit de texte.