Dosage des plaques virales : une technique pour mesurer le virus de l’herpès simplex infectieux par quantification des plaques formées dans une monocouche de cellules infectées par le virus

Pour commencer, préparez des dilutions en série du virus de l’herpès simplex, un virus infectieux enveloppé, en tampon.

Obtenez une plaque multipuits contenant une monocouche de culture de cellules épithéliales sensibles au virus. Remplacez un volume spécifique de milieu par des suspensions virales diluées, assurant une couverture monocouche uniforme. Laissez le virus s’adsorber à la surface de la cellule.

Supprimez tous les virus non adsorbés. Recouvrez la monocouche cellulaire d’un milieu contenant de la méthylcellulose, formant une couche semi-solide.

Lors de l’incubation, l’enveloppe virale et la membrane cellulaire fusionnent, libérant la nucléocapside virale renfermant le génome double brin dans le cytoplasme. De plus, le génome viral est libéré dans le noyau cellulaire.

En utilisant la machinerie cellulaire de l’hôte et la protéine du virion, le génome viral exprime des protéines virales précoces immédiates, qui régulent l’expression des gènes précoces. Les protéines virales précoces médient la réplication de l’ADN viral.

Ensuite, les gènes viraux tardifs expriment des protéines structurelles qui, avec le génome viral, s’assemblent pour produire des particules de virion de descendance. Les cellules infectées par le virus se lysent, libérant des virions.

La méthylcellulose limite le mouvement du virus, ce qui fait que les virions n’infectent que les cellules voisines et que la lyse ultérieure crée des trous dans la monocouche.

Après l’incubation, retirer la couche de méthylcellulose. Ajouter une solution de cristal de violet éthanolique. L’éthanol fixe les cellules et inactive les virus, tandis que le violet cristallin colore les cellules. En conséquence, des zones lysées claires ou des plaques apparaissent sur la monocouche de cellules violettes.

Comptez les plaques dans chaque puits à chaque dilution du virus pour déterminer le titre ou la concentration du virus infectieux.

Retirez le milieu de culture cellulaire d’un ou deux puits à l’aide d’une pipette. Soigneusement, ajoutez l’échantillon de virus dilué goutte à goutte à chaque monocouche de cellules, goutte à goutte sur le côté de chaque puits.

Répétez le processus pour un ou deux puits jusqu’à ce que toute la plaque soit remplie des échantillons de virus en plaque. Balancez doucement toute l’assiette à la main.

Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 1 heure pour permettre l’adsorption du virus. Toutes les 10 minutes, retirez la plaque de l’incubateur, secouez-la doucement à nouveau pour répartir le virus plus uniformément dans chaque puits, puis remettez-la dans l’incubateur.

Pour réduire la possibilité de compter par inadvertance l’inoculum non absorbé, retirez l’échantillon de virus des puits à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres et jetez l’échantillon dans un bécher à déchets.

Placez 2,5 millilitres d’une couche de méthylcellulose sur la plaque et remettez-la dans l’incubateur. Désinfectez le bécher à déchets, généralement avec l’ajout d’eau de Javel, d’un iodophore ou d’un virucide similaire, avant de le retirer de l’enceinte de biosécurité.

Après l’incubation de deux jours, retirez la couche de méthylcellulose d’un ou deux puits à la fois, à l’aide d’une pipette, et placez-la dans un bécher à déchets. Ajoutez environ 2 millilitres de violet cristallin à 1 % et d’éthanol à 50 % dans chaque puits. Incuber la plaque avec tous les puits remplis de la tache pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

À ce stade, désinfectez le bécher à déchets, comme démontré précédemment. Lavez vigoureusement les assiettes à l’eau du robinet, jusqu’à ce que le ruissellement soit clair.

Assurez-vous qu’il y a des différences d’environ 10 fois dans le nombre de plaques dans chaque série de dilution.