Marquage dUTP Nick médié par la transférase terminale - Essai TUNEL : une méthode in situ pour détecter la fragmentation de l’ADN dans les cellules apoptotiques

Les cellules hôtes infectées par des agents pathogènes microbiens subissent l’apoptose, c’est-à-dire la mort cellulaire programmée. Au cours de l’apoptose, les DNases dégradent l’ADN chromosomique en petits fragments, entraînant la mort cellulaire.

Pour détecter l’apoptose à l’aide du test TUNEL, prélever une lame de verre avec une section de tissu cutané déparaffinisé et réhydraté infecté par un agent pathogène fongique.

Traitez le tissu avec la protéinase-K pour inactiver les DNases cellulaires, les empêchant ainsi de dégrader potentiellement l’ADN pendant l’analyse. Ajoutez du peroxyde d’hydrogène pour éteindre la réaction et lavez la lame pour éliminer la protéinase-K n’ayant pas réagi.

Ajoutez un tampon contenant des désoxy-uridine triphosphates marqués à la digoxigénine, ou dUTP. Complétez-le avec une désoxynucléotidyl transférase terminale, une enzyme TdT et incuber. Dans les cellules apoptotiques, l’enzyme TdT catalyse la fixation des dUTP marqués aux groupes 3′-hydroxyles exposés de l’ADN fragmenté.

Ensuite, ajoutez un anticorps anti-digoxigénine conjugué à un rapporteur de rhodamine et incubez-le dans l’obscurité pour faciliter la liaison des anticorps aux dUTP marqués à la digoxigénine, conférant une fluorescence rouge lors de l’imagerie.

Traitez les échantillons de tissus avec une contre-coloration nucléaire fluorescente pour visualiser les noyaux. Placez une lamelle sur la coupe de tissu et visualisez-la au microscope à fluorescence.

La fluorescence bleue aide à identifier les noyaux de toutes les cellules dans la section tissulaire, tandis que la présence de fluorescence rouge dans les cellules colorées à la rhodamine indique une fragmentation de l’ADN due à l’apoptose.

Pour commencer cette procédure, préparez des lames de verre hydrophile avec de l’échantillon de tissu, comme indiqué dans le protocole textuel.

Pour déparaffiniser les sections de tissus, lavez les lames trois fois avec du xylène, pendant 5 minutes chacune, dans un bocal coplin. Ensuite, lavez les lames avec de l’éthanol à 100 % deux fois pendant 5 minutes chacune. Après cela, lavez les lames avec de l’éthanol à 95 % et à 70 % d’éthanol pendant 3 minutes chacune, puis lavez les lames une fois avec du PBS pendant 5 minutes.

Pour préparer des lames de contrôle expérimentales et négatives, prétraitez le tissu en ajoutant de la protéinase K fraîchement diluée directement sur les lames. Incuber les lames pendant 10 minutes à température ambiante, puis laver les lames dans du PBS deux fois pendant 2 minutes chacune.

Pour préparer des lames de contrôle positif, prétraitez le tissu avec un tampon DN, puis incubez les lames à température ambiante pendant 5 minutes. Après cela, la DNase I dissoute dans le tampon DN jusqu’à une concentration finale de 0,1 microgramme par millilitre. Ajoutez la solution d’ADN préparée aux lames. Incuber les lames pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver les côtés à l’eau distillée dans un bocal coplin cinq fois, pendant 3 minutes chacune.

Trempez la réaction dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % dans du PBS pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames dans PBS deux fois pendant deux minutes chacune. Ensuite, ajoutez un tampon d’équilibre au tissu sur les lames. Incuber pendant 10 secondes à température ambiante, puis tapoter l’excès de liquide autour de la section du tissu.

Diluez l’enzyme désoxynucléotidyltransférase terminale dans un tampon de réaction, puis ajoutez-la au tissu sur les lames expérimentales et de contrôle positif. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 heure à 37 degrés Celsius.

Après cela, placez les lames dans un bocal coplin contenant la concentration de travail du tampon d’arrêt. Agitez pendant 15 secondes, puis incubez les lames à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames avec du PBS trois fois pendant 1 minute chacune et tapotez l’excès de liquide.

Ensuite, ajoutez le conjugué anti-digoxigénine préchauffé à température ambiante directement sur le tissu. Incuber les lames pendant 30 minutes à température ambiante dans une chambre sombre humidifiée.

Une fois l’incubation terminée, lavez les lames avec du PBS quatre fois pendant deux minutes chacune. Tapotez tout excès de liquide. Ensuite, ajoutez du support de montage sur les côtés. Ajouter 15 microlitres de solution DAPI au support de montage sur les lames. Couvrez chaque lame avec une lamelle et scellez-la avec du vernis à ongles. Laissez les lames sécher dans l’obscurité.

À l’aide d’un microscope fluorescent, observez les lames dès la fin du processus de coloration.

Prenez des photos 400 fois à intervalles aléatoires le long de chaque section de peau. Comptez les cellules bleues colorées au DAPI pour vous assurer qu’au moins 100 cellules par section de peau, par animal, sont visibles. Ensuite, comptez le nombre de cellules positives à TUNEL, qui apparaissent sous forme de cellules simples rouges avec des bords de cellule clairs.