Caspase-3/7 Assay : Un test basé sur la luminescence pour quantifier l’apoptose en mesurant les activités de la caspase-3/7 dans les explants de peau de grenouille

La caspase-3 et la caspase-7 sont des protéases qui reconnaissent la séquence tétrapeptide DEVD dans les protéines cibles, les clivant à l’extrémité C du résidu d’acide aspartique. Ceux-ci jouent un rôle prépondérant dans la cascade de l’apoptose - mort cellulaire programmée.

Pour évaluer l’activité de la caspase-3/7 dans les cellules apoptotiques, commencez par un tube contenant un explant de peau d’orteil de grenouille infecté par des champignons induisant l’apoptose. Ajoutez un tampon approprié dans le tube et quelques billes métalliques.

Utilisez le battage des billes pour perturber les cellules de la peau et libérer le contenu cellulaire, y compris les protéines caspase-3/7. Centrifugez le tube, les débris cellulaires en granulation et les organites. Aspirez le surnageant riche en protéines du tube et pipetez dans les puits d’une plaque de dosage multipuits.

Complétez les puits avec le réactif de caspase luminogène. Ce réactif se compose d’un substrat proluminescent contenant le peptide DEVD dans une solution tamponnée contenant de l’ATP, des ions magnésium et l’enzyme luciférase.

Mélangez le contenu du puits et incuber. Pendant l’incubation, la caspase-3/7 clive le substrat proluminescent, libérant de l’aminoluciférine - un substrat de la luciférase - dans la solution.

En présence d’ions ATP et magnésium, la luciférase oxyde l’aminoluciférine libérée, générant un produit bioluminescent. La quantité de lumière produite pendant la réaction est proportionnelle à l’activité de la caspase.

Pour extraire les protéines d’un échantillon d’orteil de grenouille congelé, placez l’échantillon dans un tube à microcentrifuger à bouchon à vis de 1,5 millilitre, contenant 100 microlitres de tampon d’échantillon et deux billes d’acier inoxydable.

Utilisez un batteur à perles à vitesse maximale pour lyser les cellules. Après cela, placez le tube sur de la glace pendant 3 minutes, puis centrifugez le tube pour recueillir le surnageant.

Pour effectuer le dosage de la caspase 3/7 dans une plaque de 384 puits, ajoutez 10 microlitres de tampon d’échantillon à blanc et 10 microlitres d’extrait de protéine en trois exemplaires. Ensuite, pipetez 10 microlitres de réactif de caspase 3/7 disponible dans le commerce jusqu’à l’extrait de protéine et les puits vierges. Ensuite, secouez doucement la plaque pendant 15 secondes pour mélanger les deux réactifs.

Incuber à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. Enfin, utilisez un lecteur de plaque luminescente pour mesurer la luminescence de l’échantillon.