Le test de phagocytose : une technique d’immunomarquage pour visualiser l’engloutissement des cellules apoptotiques dans les cellules embryonnaires de Drosophila melanogaster

Les macrophages sont des cellules immunitaires spécialisées qui éliminent les cellules subissant l’apoptose - la mort cellulaire programmée par phagocytose.

Pour évaluer l’engloutissement des cellules apoptotiques, commencez par une lame de verre contenant des cellules embryonnaires de drosophile fixes, y compris des corps apoptotiques engloutis par des hémocytes - macrophages invertébrés.

Tout d’abord, traitez les cellules avec un réactif bloquant qui bloque les sites non spécifiques. Ajoutez des anticorps primaires qui se lient aux récepteurs croquemorts - marqueurs phagocytaires des hémocytes. Lavez l’excès d’anticorps.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués à la phosphatase alcaline qui se lient aux anticorps primaires. Maintenant, ajoutez une solution de substrat chromogène appropriée sur la lame et incuber. Pendant l’incubation, la phosphatase alcaline réagit avec le substrat chromogène pour produire des granules colorés en violet dans les hémocytes.

Ensuite, ajoutez un mélange réactionnel comprenant de la désoxynucléotidyltransférase terminale, de l’enzyme TdT et des nucléotides liés à la digoxigénine. Le TdT catalyse la fixation des nucléotides liés à la digoxigénine aux extrémités 3' OH exposées de l’ADN fragmenté dans les corps apoptotiques.

Ensuite, ajoutez des anticorps anti-digoxigénine conjugués à la peroxydase rapporteur qui se lient aux nucléotides sur le site des dommages à l’ADN. Traitez les cellules avec une solution de substrat chromogène spécifique de la peroxydase et incuberez. La peroxydase catalyse l’oxydation du substrat, générant des précipités colorés et colorant les corps apoptotiques en brun.

Enfin, visualisez les cellules au microscope optique. La coprésence de granules violets et de signaux bruns provenant des cellules indique que les hémocytes contiennent des corps apoptotiques phagocytés.

Pour immunocolorer les cellules avec un anticorps anti-Croquemort, il faut d’abord tremper la lame en série dans du méthanol, puis du PBS complété par 0,2 % de Triton X-100, suivi du PBS seul. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 20 microlitres de sérum de porc entier à 5 % dans du PBS + 0,2 % de Triton X-100, pendant 20 minutes à température ambiante. Retirez l’excès de solution bloquante et étiquetez les cellules avec 20 microlitres d’antisérum anti-Croquemort à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain matin, lavez la lame dans PBS + Triton X-100 pour cinq incubations de 10 minutes. Après le dernier lavage, rincez la lame dans du PBS pendant 10 minutes. Ensuite, étiquetez les cellules avec 20 microlitres d’IgG anti-rat marquées à la phosphatase alcaline à température ambiante pendant 1 heure.

À la fin de l’incubation, laver la lame cinq fois dans du PBS + Triton X-100 comme démontré, puis l’immerger pendant 10 minutes dans une solution tampon. Ensuite, marquez les cellules avec une solution de substrat de phosphatase et observez les cellules au microscope optique.

Lorsque de forts signaux violets apparaissent dans les granules d’hémocytes, retirez l’excès de substrat et trempez la lame dans un tampon complété par de l’EDTA pendant 5 à 10 minutes. À la fin de l’incubation, rincez les cellules avec deux lavages PBS de 5 minutes et traitez-les avec un tampon d’équilibrage pendant 10 minutes.

Après avoir retiré la solution, étiquetez les cellules avec 20 microlitres de solution terminale de désoxynucléotidyl transférase à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Ensuite, retirez la solution de la lame et faites tremper les cellules dans 0,5 millilitres de tampon d’arrêt de lavage dans 17 millilitres d’eau, pendant 10 minutes. Ensuite, rincez les cellules avec trois lavages PBS de 5 minutes et étiquetez-les avec 20 microlitres d’anti-digoxigénine peroxydase pendant 30 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver les cellules quatre fois dans du PBS, comme démontré, et tremper la lame dans un substrat de peroxydase par incréments de 30 secondes jusqu’à ce que les cellules apoptotiques brunissent. Lorsqu’une coloration optimale a été obtenue, trempez la lame dans l’eau pour arrêter la réaction de la peroxydase.