Le test in vitro sur un seul ovule rapporteur : une technique pour étudier la régulation de la traduction de l’ARNm cible pendant la maturation in vitro des ovocytes

Les ovocytes en prophase-I de la méiose sont transcriptionnellement actifs ; ils produisent des ARNm et les stockent sous une forme dormante. Au cours de la maturation, lorsque l’ovocyte entre en métaphase, les ARNm stockés sont traduits en protéines.

Pour étudier la traduction de l’ARNm, commencez par des ovocytes de souris arrêtés par la prophase I en suspension dans une goutte de milieu. Positionnez la pipette de maintien près d’un seul ovocyte pour la maintenir en position.

Prenez une pipette de micro-injection contenant un mélange rapporteur. Ce mélange contient deux types distincts d’ARNm, l’un codant pour la protéine fluorescente jaune, ou YFP - un rapporteur fusionné avec la région 3'-non traduite du gène cible - et un ARNm polyadénylé codant pour la protéine fluorescente rouge.

Injectez le mélange rapporteur dans l’ovocyte. Incuber les ovocytes micro-injectés dans un milieu de maturation complété par du cilostamide - un inhibiteur chimique qui maintient l’arrêt de la prophase I.

L’ovocyte traduit l’ARNm polyadénylé jusqu’à ce que l’intensité de la fluorescence rouge atteigne un plateau, tandis que les niveaux d’ARNm codant pour YFP sans queue de polyadénylation restent tels quels.

Transférez les ovocytes traités dans un milieu de maturation sans cilostamide, ce qui aide à reprendre la méiose, et l’ARNm cible subit une traduction pour produire la protéine cible fusionnée avec un rapporteur fluorescent jaune.

Effectuez une imagerie en accéléré pour visualiser les signaux de fluorescence à intervalles réguliers.

Les ovocytes injectés présentent des niveaux constants de fluorescence rouge, tandis que la fluorescence jaune augmente avec le temps, indiquant une traduction et une accumulation progressive des protéines rapporteures.

Pour commencer, ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite incision dans la paroi du follicule avec une aiguille de calibre 26. Isolez les COC intacts avec plusieurs couches de cellules cumulus à l’aide d’une pipette en verre à commande buccale. Utilisez une pipette plus petite et dénudez mécaniquement les COC par pipetage répété.

Aspirez les ovocytes dénudés et placez-les dans une boîte de Pétri avec un milieu de maturation complété par 1 micromolaire de cilostamide. Placez le plat dans un incubateur pendant deux heures, pour permettre aux ovocytes de récupérer du stress induit par leur isolement des follicules.

Placez un tube capillaire en verre borosilicaté de 10 centimètres de long et un extracteur mécanique pour préparer les aiguilles d’injection. Pliez la pointe de l’aiguille à un angle de 45 degrés à l’aide d’un filament chauffé pour une injection optimale. Placez des gouttelettes de 20 microlitres de milieu de collecte d’ovocytes de base dans une coupelle en polystyrène et recouvrez les gouttelettes d’huile minérale légère.

Préparez un plus grand volume de mélange de rapporteur en ajoutant 12,5 microgrammes par microlitre d’Ypet UTR et de mCherry chacun. Stockez des aliquotes de ceux-ci à moins 80 degrés Celsius. Lors de la décongélation, centrifugez l’aliquote pendant deux minutes à 20 000 x g. Ensuite, transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Chargez l’aiguille d’injection avec environ 0,5 microlitre de mélange rapporteur. Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection dans les supports et positionnez-les dans la gouttelette du milieu de collecte d’ovocytes.

Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien. Placez les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injectez 5 à 10 picolitres du mélange rapporteur. Incuber les ovocytes dans le milieu de maturation avec 1 cilostamide micromolaire pendant 16 heures pour permettre au signal mCherry de se stabiliser.

Pour la microscopie time-lapse, préparez une boîte de Pétri avec deux gouttelettes de 20 microlitres de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté. Une gouttelette avec 1 micromolaire de cilostamide pour contrôler les ovocytes arrêtés par la prophase I, et une gouttelette sans cilostamide pour les ovocytes en maturation. Couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère et placez-les dans l’incubateur.

Après la pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Conservez certains ovocytes dans un milieu de maturation avec 1 micromolaire de cilostamide comme groupe témoin d’ovocytes de prophase I.

Transférez les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la boîte de microscope time-lapse préalablement préparée. Regroupez les ovocytes à l’aide d’une pipette en verre fermée pour éviter leur mouvement pendant l’enregistrement.

Placez la parabole sous le microscope équipé d’un système d’éclairage à diodes électroluminescentes, et une platine motorisée équipée d’une chambre environnementale maintenue à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit du texte.

Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse en cliquant sur « Applications », puis sur « Acquisition multidimensionnelle ». Sélectionnez le premier onglet « Principal » et sélectionnez « Time-lapse », « Plusieurs positions de scène » et « Plusieurs longueurs d’onde ».

Sélectionnez l’onglet « Enregistrement » pour saisir l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée. Ensuite, sélectionnez l’onglet « Time-lapse » pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps. Sélectionnez l’onglet « Étape ». Activez le fond clair et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre et en sélectionnant « Acquérir », « Acquérir » et « Afficher en direct ».

Une fois les ovocytes localisés, revenez à la « Fenêtre d’acquisition multidimensionnelle » et appuyez sur « + » pour définir l’emplacement des ovocytes. Sélectionnez l’onglet « Longueurs d’onde » et définissez trois longueurs d’onde différentes pour le fond clair, YFP et mCherry. Ajustez l’exposition pour Ypet et mCherry. Ensuite, lancez l’expérience time-lapse en cliquant sur « Acquérir ».

Pour l’analyse de la traduction UTR d’Ypet-3', effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte. L’ovocyte lui-même en le coupant sur « Région de l’Ellipse » et une petite région entourant l’ovocyte à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan en cliquant sur « Région rectangulaire ». Exportez les données de mesure de la région vers une feuille de calcul en cliquant sur « Ouvrir le journal », puis sur « Données du journal ».

Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points temporels mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région de l’ovocyte séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry.