Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:01 min • July 8th, 2025
Le film lacrymal - le liquide protecteur qui recouvre l’œil - aide à lubrifier et à maintenir les cellules épithéliales cornéennes oculaires, les CEC, dans un état sain et métaboliquement actif. Un film lacrymal compromis, comme dans la sécheresse oculaire, peut provoquer l’évaporation des larmes des CEC, augmentant leur sensibilité aux infections et aux dommages inflammatoires.
Les formulations de larmes artificielles stabilisent le film lacrymal et améliorent la rétention d’eau, empêchant ainsi la déshydratation cellulaire.
Pour dépister les effets cytotoxiques d’une formulation de larme artificielle sur les CEC à l’aide du test alamarBlue, commencez par une culture adhérente de CEC d’origine humaine dans un milieu approprié. Jetez le support.
Incuber la culture cellulaire avec une concentration spécifique de la formulation de larme artificielle. La formulation de la larme forme un revêtement sur les cellules. En fonction de l’effet cumulatif des ingrédients constitutifs, les cellules peuvent subir une perte d’activité métabolique.
Ensuite, ajoutez la solution alamarBlue contenant de la résazurine, un colorant de couleur bleue, faiblement fluorescent, non toxique et soluble dans l’eau.
La résazurine se diffuse dans les cellules et est irréversiblement réduite dans les cellules métaboliquement actives, principalement par les réductases mitochondriales, car elle accepte les électrons des donneurs d’électrons des processus métaboliques de respiration, formant une résorufine de couleur rose, hautement fluorescente, qui se déplace librement hors des cellules dans la solution. Transférez la solution contenant de la résorufine dans une nouvelle plaque multi-puits.
À l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence, mesurez l’intensité de fluorescence. Une faible valeur d’intensité de fluorescence indique une faible activité métabolique cellulaire, suggérant des effets indésirables de la formulation lacrymale sur les CEC.
Retirez les milieux de culture des puits et traitez immédiatement les cellules avec 150 microlitres d’une formulation d’essai ou d’une solution de contrôle des milieux. Ensuite, incubez les cellules pendant 30 minutes.
Retirez la solution d’essai des cellules et ajoutez 0,5 millilitre de solution de colorant métabolique à 10 %. Incuber les cellules pendant encore quatre heures.
Après l’incubation, retirez 100 microlitres de solution de colorant de chaque puits et transférez-la dans une plaque de 96 puits. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la fluorescence de chaque puits, en réglant l’excitation à 540 nanomètres et l’émission à 590 nanomètres.