Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 2:58 min • July 8th, 2025
Les peptides pénétrant dans les cellules, les CPP, des peptides courts et chargés positivement, peuvent interagir avec les membranes cellulaires et les traverser, facilitant ainsi l’administration de cargaisons imperméables aux cellules.
Pour étudier le potentiel de perméabilisation membranaire d’un test de CPP in vitro à l’aide d’un mimétisme de membrane cellulaire, il faut commencer par une grande vésicule unilamellaire en suspension.
Les LUV comprennent une bicouche phospholipidique chargée d’une sonde fluorescente imperméable à la membrane et d’une paire de quencher correspondante. À l’intérieur des vésicules, le quencher interagit avec la sonde fluorescente en raison de leur proximité, provoquant une extinction de fluorescence.
Pipeter la suspension LUV dans une cuvette à fluorescence de quartz et diluer à l’aide d’un tampon. Ajoutez une barre magnétique. Transfert vers un spectrofluorimètre avec agitation magnétique pour éviter la sédimentation des LUV pendant le fonctionnement. Déterminez la fluorescence de fond pour éliminer toute fuite de LUV.
Ajoutez la concentration souhaitée de CPP à la suspension LUV à intervalles réguliers.
Sur la base de l’hydrophobicité et de la charge des résidus d’acides aminés des CPP, ils perturbent la membrane lipidique LUV, entraînant une pénétration et une perméabilisation de la membrane.
L’endommagement de la membrane vésiculaire provoque une fuite de la sonde fluorescente et de l’extincteur dans la solution environnante, augmentant ainsi leur séparation spatiale. En conséquence, la sonde présente une fluorescence.
L’ajout d’une solution CPP supplémentaire entraîne une augmentation de la perméabilisation des LUV et de l’intensité de la fluorescence. Une augmentation de l’intensité de la fluorescence avec l’ajout de CPP suggère le potentiel de perméabilisation membranaire du peptide.
Pour mesurer la fuite de fluorescence, diluez les LUV dans 1 millilitre de HEPES Buffer 2 dans une cuvette de fluorescence de quartz jusqu’à une concentration finale de 100 micromolaires, et ajoutez un agitateur magnétique pour faciliter l’homogénéisation de la solution pendant l’expérience.
Mesurez les LUV seuls pendant les 100 premières secondes pour évaluer la fluorescence de fond, avant de mesurer la fuite comme une augmentation de l’intensité de la fluorescence lors de l’ajout d’aliquotes de solution peptidique au cours des 900 prochaines secondes.
Pour mesurer une fuite de fluorescence de 100 % en tant que contrôle positif, ajoutez 1 microlitre de Triton X-100 aux LUV pour solubiliser les vésicules, ce qui permet de désaltérer complètement la sonde pendant les 100 dernières secondes de l’analyse. Ensuite, utilisez la formule pour calculer le pourcentage de fuite à chaque point temporel.