Dosage des protéines solubles pour quantifier la teneur en protéines solubles dans les tissus végétaux

Pour quantifier la teneur en protéines solubles dans un tissu végétal, dans un tube, commencez par une quantité appropriée de tissu végétal moulu et lyophilisé.

Ajouter de l’hydroxyde de sodium, un alcali, dans le tube et sonifier. L’environnement alcalin avec les forces mécaniques perturbe les cellules, libérant du contenu intracellulaire, y compris des macromolécules - protéines solubles et glucides. Incuber à des températures plus élevées.

En présence de chaleur, les alcalis provoquent l’hydrolyse des protéines, formant des peptides plus petits et augmentant la solubilité des protéines. De plus, les glucides se dégradent.

Centrifugez le mélange. Prélever le surnageant contenant des protéines solubilisées. Ajouter de l’acide chlorhydrique pour neutraliser le pH.

Traitez l’échantillon avec de l’acide trichloracétique, TCA. Le TCA perturbe la coquille d’hydratation entourant les protéines, entraînant l’agrégation et la précipitation des protéines.

Centrifugez et retirez le surnageant contenant du TCA. Lavez la pastille de protéine avec de l’acétone glacée pour éliminer tout résidu de TCA, qui pourrait interférer avec l’estimation des protéines solubles.

Faites sécher l’acétone à l’air. Remettez en suspension la pastille de protéine dans de l’hydroxyde de sodium. Diluer avec de l’eau déminéralisée. Transférer dans les puits d’une plaque multi-puits.

Ajouter une solution acide de colorant Coomassie Brilliant Blue G-250. Dans des conditions acides, le colorant se lie aux résidus d’acides aminés basiques dans les protéines solubilisées, ce qui donne un complexe protéine-colorant bleu.

À l’aide d’un spectrophotomètre, on peut mesurer l’absorbance du complexe protéine-colorant, proportionnelle à la teneur en protéines solubles dans les tissus végétaux.

Pour commencer, pesez des échantillons répétés de chaque tissu dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre étiquetés. Ensuite, enregistrez la masse précise de chaque échantillon. À l’aide d’une micro-pipette, ajoutez 500 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire dans chaque tube. Fermez bien les couvercles et sioninez les tubes pendant 30 minutes.

Ensuite, placez les tubes dans un bain d’eau chaude préchauffé pendant 15 minutes. Après cela, centrifugez les tubes à 15 000 g pendant 10 minutes. Pipeter le surnageant dans de nouveaux tubes de microcentrifugation marqués à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette pour chaque échantillon.

Ajoutez 300 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire à la pastille et répétez la centrifugation pendant 10 minutes. Après cela, retirez le surnageant et transférez-le dans les tubes contenant le surnageant de la première centrifugation.

Pour neutraliser le pH du surnageant, ajoutez 11 microlitres d’acide chlorhydrique 5,8 molaires. Utilisez du papier tournesol pour confirmer que le pH est d’environ 7.

Ensuite, ajoutez 90 microlitres d’acide trichloracétique à 100 % dans chaque tube. Ensuite, incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez les échantillons à 13 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Avec précaution, utilisez une ligne de vide et une pointe de micropipette en verre pour éliminer l’acide trichloracétique.

Faites très attention à ne pas déranger le granulé avec l’embout d’aspiration.

Ensuite, lavez la pastille avec 100 microlitres d’acétone refroidie à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, laissez l’acétone s’évaporer dans une hotte. Dissoudre la pastille de protéine avec 1 millilitre d’hydroxyde de sodium. Des cycles supplémentaires de chauffage, de vortex et de sonication peuvent être nécessaires.

Ajouter 160 microlitres de chaque solution étalon d’IgG à une plaque de 96 puits en trois exemplaires, en commençant par la position A1. Ensuite, dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, ajoutez 50 microlitres de chaque solution d’échantillon à 950 microlitres d’eau distillée. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de chaque échantillon dilué sur la plaque du puits en trois exemplaires, en commençant par la position H1. Ajoutez 100 microlitres d’eau distillée à tous les puits d’échantillonnage vierges et inconnus.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 40 microlitres de colorant protéique bleu brillant Coomassie G-250 dans chaque puits de la plaque. À l’aide d’une aiguille, faites éclater les bulles présentes dans les puits. Après cela, laissez la plaque incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre à microplaques pour enregistrer les valeurs d’absorbance de chaque puits à 595 nanomètres.