Essai de croissance basé sur la luciférase pour quantifier la reproduction intracellulaire du parasite

Toxoplasma gondii - un protozoaire unicellulaire - est un parasite anaérobie obligatoire, se reproduisant uniquement à l’intérieur des cellules hôtes.

Pour quantifier la croissance intracellulaire du parasite à l’aide d’un test basé sur la luciférase, prenez une suspension de cellules parasitaires exprimant la luciférase - une enzyme qui produit de la luminescence lors de sa réaction avec son substrat. Ajoutez la suspension à une culture de fibroblastes de prépuce humain et incubez pendant une durée adéquate.

Le parasite se lie aux récepteurs de la cellule hôte et est internalisé via un processus endocytaire, formant une vacuole parasitophore. La structure fournit une niche pour que le parasite se reproduise.

Après l’infection, aspirer le milieu, en éliminant les parasites non internalisés. Ajoutez un tampon de lyse contenant un détergent et de la luciférine - un substrat pour la luciférase. Le détergent contenu dans le tampon crée des pores dans la membrane cellulaire et lyse complètement les cellules, ce qui entraîne la libération de luciférase.

L’enzyme libérée oxyde les molécules de luciférine, émettant de la lumière. Mesurez l’intensité de la luminescence pour déterminer l’activité de la luciférase. À l’aide de puits répliqués contenant des cellules hôtes infectées, mesurez l’activité de la luciférase à des intervalles prédéterminés après l’infection.

Tracez l’intensité de luminescence normalisée en fonction des intervalles de temps pour obtenir les changements de pli dans la croissance du parasite au fil du temps. Une augmentation temporelle de l’intensité indique une multiplication réussie du parasite.

Tracez les valeurs sur une échelle logarithmique pour calculer la pente de la courbe, représentant le temps de doublement du parasite.

Pour effectuer un test de croissance de Toxoplasma basé sur la luciférase, commencez par aspirer soigneusement le milieu à partir de cultures de microplaques pré-ensemencées de 96 puits de fibroblastes de prépuce humain, et inoculez 150 microlitres de suspension sans parasite dans les puits dans un format à trois colonnes et cinq rangées.

Après une incubation de quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, aspirez soigneusement le milieu de chaque puits pour éliminer les parasites non envahis, et remplissez les puits de chaque rangée, sauf la première, avec un milieu sans rouge de phénol à température ambiante. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’une solution de substrat de luciférase de 12,5 micromolaires dans du PBS dans chaque puits de la rangée supérieure, et incubez les microplaques pendant 10 minutes à température ambiante pour permettre une lyse cellulaire complète.

À la fin de l’incubation, mesurez l’activité de la luciférase sur un lecteur de microplaques. Chaque lecture représente le nombre initial de parasites envahis quatre heures après l’infection. Répétez l’analyse toutes les 24 heures pendant les quatre jours suivants sans changer de support.

Pour calculer le changement de pli normalisé de la croissance du parasite, chaque lecture peut être divisée par la lecture initiale quatre heures après l’infection. Le log2 du changement de pli normalisé de la croissance du parasite peut ensuite être tracé par rapport à chaque point temporel et soumis à une fonction de régression linéaire pour obtenir la pente, qui représente le temps de doublage.